《Journal of Anatomy》：Human foetal cortical slice cultures: A translational platform for studying early neurodevelopment
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发育中的人新皮层以细胞构筑、神经元组织与活动的复杂动态变化为特征。研究人员此前已描述，取自伦理合规来源组织的人胎儿皮层器官型切片培养可用于研究上述过程。该培养体系可维持数周，并呈现当前类器官模型无法复制的正常发育脑特征。此类培养使实验性干预成为可能，例如检测基
发育中的人新皮层以细胞构筑、神经元组织与活动的复杂动态变化为特征。研究人员此前已描述，取自伦理合规来源组织的人胎儿皮层器官型切片培养可用于研究上述过程。该培养体系可维持数周，并呈现当前类器官模型无法复制的正常发育脑特征。此类培养使实验性干预成为可能，例如检测基因突变的影响。本研究拓展了该模型的表征。研究人员报道，这些器官型培养保留了发育中皮层壁的层状组织，并显示神经元形态具有相当高的多样性。采用针对794个基因的批量mRNA杂交（"人类神经病理学"基因组合），研究人员在16–18孕周（post-conceptional weeks，pcw）取材的不同组织样本中，鉴定出体外培养0至14天（days in vitro，DIV）间一致的基因表达演变模式。为将这一结果置于正常发育模式的背景中，研究人员将本数据集与既往采集的7–17 pcw组织RNAseq数据（https://www.hdbr.org/expression）进行比较。结果提示，体外培养中的许多基因表达变化遵循先前的发育轨迹，但另一些则明显偏离，包括与应激反应相关的上调基因，以及与血管功能相关的下调基因。后一效应可能反映培养中血管发育的相对冗余。值得注意的是，多种与前、后突触功能相关的基因，包括谷氨酸和GABA受体，持续强表达。与此一致，研究人员通过将遗传编码Ca2+指示剂GCaMP6f靶向表达于有丝分裂后神经元，在subplate（SP）观察到自发神经元网络活动。应用GABAA受体或缝隙连接阻断剂后，神经元Ca2+瞬变频率增加。相反，谷氨酸能受体拮抗剂显著降低活动，电压门控钠通道阻断则将其消除。在SP和subventricular zone局部施加谷氨酸可直接触发神经元Ca2+瞬变，而cortical plate神经元反应较弱。这与上述区域谷氨酸受体亚单位免疫反应性水平一致。总之，器官型培养显示出功能性突触网络，并得到相关突触蛋白机制持续表达的支持。这些数据进一步验证了器官型培养作为研究与干预人新皮层早期产前发育模型的可行性，而该时期在其他情况下难以研究。
研究背景方面，研究早期脑发育及神经系统疾病有多种模型系统，各有优劣。动物模型可开展体内外研究，但啮齿类与人类在同源基因表达、脑体积与结构等方面存在关键差异，限制了结果的临床转化。人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）可分化为特定细胞类型，但缺乏脑的宏观组织。类器官及组装体（assembloids）增加了细胞多样性和部分宏观结构，但缺乏subplate（SP）的直接同源结构；SP是短暂存在、对大脑皮层发育至关重要的结构。人SP约在13 pcw形成，约至足月后基本消失，其存在期几乎与宫内期重合，难以研究；啮齿类SP仅为薄层细胞且发育中不增大。为此，研究人员此前建立了14–18 pcw人胎儿皮层器官型切片培养模型，保留皮层壁结构包括SP层，并适于遗传操作。本研究在无基因操作条件下继续表征该基线模型，聚焦取材时细胞组成与基因表达谱及其体外随时间的变化，并考察自发神经元活动的性质。
研究人员开展的研究与结论：对16–18 pcw人胎儿皮层器官型切片培养进行形态学、转录组与功能表征，发现培养保留层状组织与神经元形态多样性，多数基因表达变化延续正常发育轨迹，部分偏离（应激相关上调、血管相关下调），突触相关基因持续表达，SP存在功能性自发突触网络。其意义在于进一步验证该模型可用于研究与干预人新皮层早期产前发育。
关键技术方法（不超过250字）：采用伦理合规来源的人胎儿脑组织（Human Developmental Biology Resource，HDBR，项目200428；16–18 pcw，共6例供体）制备器官型切片培养；以腺相关病毒（adeno-associated viral，AAV）载体递送GCaMP6f与GFP；进行钙成像及药理学干预；采用NanoString nCounter对794个基因进行转录组分析并结合既往RNAseq数据作发育轨迹比较；进行免疫组织化学与共聚焦成像定量突触标志物。
研究结果：3.1 人器官型切片培养中各皮层板层神经元与祖细胞的维持——通过免疫荧光与AAV9-CMV-GFP标记，发现培养2周后CP、SP、SVZ等板层仍可辨识，MAP2、TBR1阳性有丝分裂后神经元富集于CP与SP，GFAP、HOPX、SOX2标记异质性放射状胶质祖细胞；GCaMP6f标记显示SP神经元形态多样（双簇状、单簇状等），CP神经元较小。3.2 培养过程中的整体转录组重塑——通过NanoString分析0与14 DIV切片，主成分分析显示两者清晰分离，鉴定134个差异表达基因（62上调、72下调），富集于"细胞间信号传导与相互作用"和"细胞周期"通路；上调基因多与星形胶质细胞/小胶质细胞应激反应及p53通路相关，下调基因多与血管生成与血脑屏障完整性相关；与HDBR RNAseq数据比较并经Monte Carlo模拟，83.4%基因的表达变化遵循既有发育趋势。3.3 SP神经元形成自发活动的突触网络——通过GCaMP6f钙成像及药理学干预，发现SP自发活动在GABA能或缝隙连接阻断后频率增加，谷氨酸能拮抗剂降低活动，TTX消除活动。3.4 SP与SVZ诱发电活动高于CP——通过局部压力喷射谷氨酸，发现长期培养中SP与iSVZ/VZ反应显著高于CP；GABA单独不引发活动，与谷氨酸共施可降低反应，提示GABA能效应为抑制性。3.5 突触标志物在SP高表达——通过免疫组化定量HOMER1、NR1、GluA2，发现三者跨板层差异显著且以SP最高、CP最低，HOMER1与NR1、GluA2表达高度相关，且与谷氨酸诱发Ca2+瞬变强度匹配。
讨论与结论：研究结论指出，器官型培养显示功能性突触网络，并得到相关突触蛋白机制持续表达的支持；这些数据进一步验证了器官型培养作为研究与干预人新皮层早期产前发育模型的可行性，而该时期在其他情况下难以研究。
