《Journal of Neurochemistry》：Emerging Brain Tumor Organoid Models for Studying Tumor Heterogeneity, Microenvironmental Interactions, and Therapeutic Response
脑肿瘤在遗传和细胞水平上具有高度异质性，并与神经、血管、免疫及细胞外基质微环境广泛相互作用，而常规实验模型难以完整重现这些特征。本综述系统阐述了脑肿瘤类器官（brain tumor organoids）的构建策略、在脑肿瘤研究中的应用现状，以及为扩大其应用所必须克服的挑战。现有构建方法主要沿两条基本独立的维度展开：一是肿瘤细胞来源，可直接取自患者组织或通过明确的基因改造获得；二是周围微环境的处理方式，既保留源组织的内源性成分，也可进行人工重构。研究人员重点讨论了这些模型在解析肿瘤起始遗传驱动因素、瘤内异质性、肿瘤-微环境相互作用、侵袭机制以及患者特异性治疗反应与耐药性方面的应用。在这些研究领域中，类器官提供了具有实验可操作性的技术平台，使研究人员能够在不失人类疾病关键特征的前提下，探究肿瘤细胞状态可塑性、肿瘤-神经相互作用、微环境对肿瘤行为的调控以及治疗反应的差异性。与此同时，该类器官模型的建立仍具有可变性，长期传代过程中可能出现细胞群体偏离，且血管和免疫区室的表征仍不完善。因此，脑肿瘤类器官是对二维培养体系（two-dimensional culture systems）、基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse models, GEMMs）和患者来源异种移植模型（patient-derived xenografts, PDXs）的补充而非替代。未来的进展将依赖于类器官构建与表征的严格标准化，并根据具体的实验或治疗问题，有选择地整合生物学与工程学复杂性。
**1 Overview**
中枢神经系统肿瘤约占所有恶性肿瘤的1.6%，脑肿瘤是成人和儿童癌症相关发病和死亡的主要原因。胶质瘤占原发性恶性脑肿瘤的约80%，其中胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）是最具侵袭性的类型，5年生存率仅约5%-7%。有效治疗策略仍然有限，部分原因是肿瘤具有显著的肿瘤间和瘤内异质性，并受肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）影响。TME是由细胞和细胞外成分组成的动态生态系统，在肿瘤起始和进展过程中不断演化。传统模型存在固有局限：二维培养缺乏三维架构和TME成分，在长期体外传代中可能出现基因组不稳定性；基因工程小鼠模型存在物种差异且不能完全重现人类瘤内异质性；患者来源异种移植模型建立时间长、移植效率可变，且不能模拟早期肿瘤发生。因此，需要更具生理相关性的人类模型。人源多能干细胞（pluripotent stem cell, PSC）技术和三维培养系统的进步推动了类器官基癌症模型的发展。脑肿瘤类器官占据传统体外和体内模型之间的中间位置，结合了细胞培养的实验可及性和天然组织的部分架构与细胞复杂性。
**2 Generating Organoid Models of Brain Tumors**
理想的实验性癌症模型应捕捉人类恶性肿瘤的时空异质性和TME复杂性，同时具有可重复性和成本效益。脑肿瘤的行为受多种细胞、血管和结构成分的动态互作影响。氧气和营养物质的扩散限制约为100至200 μm，超过该厚度且无灌注则形成缺氧核心。因此，没有单一模型能完全重现脑肿瘤生物学的各个方面。现有构建方法沿两条基本独立的轴变化：肿瘤细胞来源和周围微环境控制程度。
**2.1 Patient-Derived Organoids**
患者来源肿瘤类器官（patient-derived tumor organoids, PDOs）直接从患者肿瘤标本建立。解离法基于ECM支持，依赖Matrigel提供富含层粘连蛋白和胶原的ECM；另一种策略是将显微切割的肿瘤片段在化学限定、无生长因子培养基中培养，依赖组织保留的基质。解离法产生更均匀、可扩展的培养物但丢弃天然基质和大部分非恶性细胞；组织片段培养保留局部组织架构和常驻细胞群，但标本间变异较大。这些策略已应用于WHO I-IV级胶质瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤及儿科肿瘤等多种类型。PDOs能保留亲本肿瘤的细胞外基质架构和细胞组成成分，包括CD31
+内皮结构、CD68
+巨噬细胞和/或Iba1
+小胶质细胞。然而，这些非恶性种群的保留通常不完全且随时间下降，大多数方案不能建立灌注血管或稳定的免疫龛。PDOs可快速建立、连续传代并冷冻保存，便于建立类器官生物库。然而，培养过程中微环境复杂性的逐渐丧失限制了其模拟不断演变的肿瘤生态系统的能力。
**2.2 Tumor-Organoid Co-Culture Models**
肿瘤-类器官共培养系统利用癌症干细胞（cancer stem cells, CSCs）的高度浸润能力。胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cells, GSCs）与人源大脑类器官共培养开发的GLICO模型可模拟肿瘤侵袭。为改善免疫龛，研究人员将肿瘤类器官与肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TILs）或外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）共培养，可维持CD45
+白细胞、CD4
+和CD8
+ T细胞、CD7
+自然杀伤细胞和CD68
+巨噬细胞。血管成分可通过共培养整合，患者来源内皮细胞可形成小管毛细血管样网络。鉴于血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的重要性，来自血管类器官（blood vessel organoid, BVO）的预分化血管簇可生成含CD31
+内皮细胞、CD140b
+周细胞、ZO-1
+紧密连接的血管结构。这些系统仍依赖扩散而非生理性灌注。目前，神经共培养最为成熟，免疫共培养仍处于维持白细胞群阶段，血管化策略在肿瘤背景下发展最不充分。
**2.3 Genetically Engineered Organoids**
遗传修饰可在PSC、拟胚体和成熟类器官阶段引入。稳定修饰通过基因组整合维持，瞬时方法一般应用于成熟类器官。早期研究使用CRISPR-Cas9将HRASG12V表达与TP53破坏相结合产生浸润性胶质母细胞瘤样肿瘤。neoCOR通过SB转座酶介导的致癌基因过表达结合CRISPR-Cas9介导的靶向突变开发，重现了人GBM的组织病理学特征、谱系特异性细胞状态及疾病相关转录组程序。将C228T TERT启动子突变与TP53 R248Q、PTEN缺失或NF1缺失组合产生不同GBM亚型样类器官。这些模型可起始测试因果性，但无法捕捉已确立肿瘤的基因复杂性。遗传工程还提供了脑类器官血管化的额外途径，将多西环素诱导型ETV2引入人胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）生成血管化人脑类器官（vascularized human cerebral organoids, vhCOs），但尚未适应脑肿瘤类器官模型。
**2.4 Bioprinted Tumor Models**
生物打印实现对细胞和ECM基生物墨水的受控空间组织。Kenzan无支架生物打印将多细胞球体排列融合生成自身ECM；挤出式生物打印生成保留干性特征并表现出药物反应模式的胶质瘤构建体；同轴生物打印生成核-壳几何结构；数字光处理（digital light processing, DLP）生物打印提供最高空间控制精度。这些方法引入生物墨水组成、打印参数、剪切应力等工程约束。
**2.5 Organoid-on-a-Chip**
类器官芯片平台通过微流控与三维培养整合，提供持续流动下氧气和营养物的受控递送。血管化类器官芯片（vascularized organoid-on-a-chip, VOoC）系统支持可灌注微血管网络形成，可将肿瘤类器官整合到水凝胶区室中以模拟肿瘤-血管相互作用。更高级的系统可重建患者特异性血管层次。这些平台的主要贡献在于灌注控制，但通量降低。
**3 Application of Organoids in Brain Tumor Research**
结合分子谱分析和受控扰动策略，类器官为研究遗传驱动因素、细胞异质性、微环境相互作用、侵袭程序和治疗耐药机制提供了实验可处理平台。
**3.1 Genetic Drivers of Tumor Initiation**
研究人员使用CRISPR/Cas9将致癌改变单独或组合引入大脑类器官，鉴定了多种可诱导肿瘤形成的改变。MYC过表达产生类似中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤（CNS primitive neuroectodermal tumor, CNS-PNET）的肿瘤。CDKN2A/B缺失结合EGFR或EGFRvIII过表达，或同时缺失NF1、PTEN或TP53产生GBM样肿瘤。GBM neoCORs表现出侵袭程序协调激活，伴随TIMP2和TIMP3以及紧密连接基因CLDN1、CLDN2、CLDN3和OCLN表达降低。
**3.2 Intratumoural Heterogeneity and Microenvironmental Interactions**
PDOs保留了亲本肿瘤的特定分子和表型特征。在脑膜瘤PDOs中，单细胞RNA测序显示类器官保留了瘤内异质性，包括恶性SULT1E1
+群体。共培养模型显示GBM细胞保留了主要恶性细胞状态，包括神经前体细胞样（neural progenitor cell-like, NPC-like）、少突胶质细胞前体细胞样（oligodendrocyte precursor cell-like, OPC-like）、星形胶质细胞样和间质样（mesenchymal, MES-like）群体，并揭示了通过胞外囊泡的肿瘤衍生mRNA和蛋白质转移。人类类器官肿瘤移植（human organoid tumor transplantation, HOTT）系统保留了稳定的患者样神经肿瘤微环境（neural tumor microenvironment, nTME）。so-HOTT变体证明了功能性谷氨酸能神经元到肿瘤的突触连接，遗传和药理学抑制α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors, AMPARs）和海人酸受体（kainate receptors, KARs）改变了肿瘤细胞组成。
**3.3 Tumor Invasion Mechanisms**
SMPD3敲除显著增加肿瘤细胞浸润。GBM PDO-大脑类器官组装体重现了单核和集体侵袭模式。慢性缺氧逐渐将星形胶质细胞重编程为促肿瘤状态，通过分泌FGF1/2、SPP1、PDGFA和PTN促进胶质瘤干细胞扩增。兴奋性神经元增强GBM增殖和侵袭。
**3.4 Organoids in Drug Screening and Therapy Resistance**
GLICO模型中GSCs对替莫唑胺（temozolomide, TMZ）或卡莫司汀（carmustine, BCNU）和放疗的耐药性明显高于二维培养。GBM类器官（GBM organoids, GBOs）药物反应谱更准确地区分TMZ敏感和耐药病例。耐药机制涉及DNA修复通路富集和CENPU介导的RAD51表达增强。来自弥漫性内在桥神经胶质瘤（diffuse intrinsic pontine glioma, DIPG）异种移植系的类器官显示了阿贝马利昔联合治疗的协同作用。PD-GBOs可在约2周内用于功能药物筛选。在临床试验中评估靶向EGFR和IL13Rα2的双价CAR-T细胞产生了显著的肿瘤溶解。
**4 Limitations, Standardization, and Future Directions**
**4.1 Biological and Technical Limitations**
脑肿瘤类器官的临床应用仍受TME表征不完整的限制。PDOs建立效率受肿瘤亚型和氧张力影响，IDH1野生型GBM生成率高于突变型和复发性肿瘤。5%生理氧条件可增加建立效率。患者来源原位异种移植（patient-derived orthotopic xenograft, PDOX）来源类器官为有限肿瘤材料提供替代来源。个体化患者肿瘤类器官（individualized patient tumor organoids, IPTOs）通过最小程度处理直接植入肿瘤组织，维持了区域异质性和稳定的血管结构。长期体外培养导致细胞漂移，免疫群体尤其易受影响。
**4.2 Microenvironmental Complexity and Engineering Challenges**
确定需要纳入TME的哪些成分是主要挑战。血管化类器官系统是否忠实地重现脑肿瘤血管特征仍是一个悬而未决的问题。血管化和免疫成分的组合说明了系统的潜力。类器官芯片通量低，每个装置支持的类器官相对较少。生物打印引入生物墨水选择和剪切应力等约束。
**4.3 Standardization and Future Directions**
缺乏类器官生成、维持、表征和功能测试的标准化方法是领域的更广泛挑战。未来开发应优先考虑生物学相关性，整合选定的免疫和血管成分、受控灌注和空间定义的微环境，使类器官从多功能的实验系统演变为更标准化和预测性的平台，以理解肿瘤进化、评估治疗反应并指导精准治疗。
