基于设计的多重序列比对引导AlphaFold改进环介导蛋白质-蛋白质相互作用的建模

《Protein Science》：Designed multiple sequence alignments guide AlphaFold for improved modeling of loop-mediated protein–protein interactions

精准建模合成性蛋白质-蛋白质相互作用对于设计治疗药物、诊断试剂和分子成像试剂至关重要。尽管深度学习已经变革了蛋白质结构预测领域，但由于结合界面处共进化信号弱以及显著的构象可变性，由柔性环介导的异源复合物（如抗体、纳米抗体和单克隆抗体中的环）的建模仍具挑战性。本研究提出一个框架，利用通过ProteinMPNN界面设计生成的合成多重序列比对（MSAs）来指导AlphaFold对环介导相互作用的预测。针对纳米抗体、抗体和单克隆抗体-抗原复合物的基准测试表明，设计的MSAs编码了界面特异性接触信息，可通过两种互补方式加以利用。首先，基于设计MSAs条件的AlphaFold2-Multimer和AlphaFold3预测能够对兼容界面产生可信且准确的结构，同时对不兼容序列或对接姿态产生低置信度或结构不一致的预测，从而实现对候选蛋白质-蛋白质复合物模型的改进评估——这尤其适用于蛋白质设计。其次，当应用于AlphaFold预测的结构时，设计的MSAs可指导结构优化和重排序，使得研究人员能够在无需穷举采样的情况下，开发出一种改善低置信度情况下盲结构预测的策略。综上所述，这些结果确立了设计MSAs作为可控输入用于结构预测的地位，并在蛋白质设计和具有挑战性的蛋白质-蛋白质相互作用的盲预测中具有应用前景。

研究背景与问题

蛋白质-蛋白质相互作用的精准建模是理解细胞机制以及设计用于生物医学和生物技术应用的合成蛋白结合剂的基础。深度学习方法的出现，例如AlphaFold2（AF2）和AlphaFold2-Multimer（AFM），通过从氨基酸序列精准预测单体和多聚体结构，极大地推动了该领域的发展。这些方法很大程度上依赖于多重序列比对（MSAs）所编码的共进化信息，特别是对于蛋白质复合物而言，配对MSAs能够捕捉链间共进化信号，从而指导结合界面的预测。然而，对于合成性和异源复合物，尤其是那些由高度灵活的互补决定区（CDRs）介导识别的抗体、纳米抗体和单克隆抗体-抗原复合物，其结合界面缺乏强共进化信号，导致预测极具挑战性。尽管AlphaFold3（AF3）通过扩散架构和大量种子采样显著改善了抗体-抗原预测，但这带来了巨大的计算成本，限制了其在大规模筛选中的应用。此外，在设计管线中，由于难以区分是因内在建模困难导致的预测失败还是因设计缺陷导致的无效结合，评估从头设计的环介导结合剂变得尤为困难。因此，亟需一种既能高效评估蛋白设计又能改进困难复合物结构预测的方法。

研究内容与结论

为解决上述问题，研究人员提出并验证了一个利用通过ProteinMPNN界面设计生成的合成MSAs来引导AlphaFold预测的框架。该框架包含两个互补组成部分：一是评估功能，即利用从实验结构设计的MSAs，使AlphaFold仅对兼容的序列-结构组合产生高置信度、准确的预测，而对不兼容的组合则给出低置信度或结构不一致的结果，从而实现正确与错误模型的判别；二是优化功能，即从部分准确的结构模型出发，利用设计的MSAs引导AlphaFold朝向更精确的构象进行结构优化。将该策略应用于盲结构预测，通过对低置信度的AF3预测进行聚类、优化和重新排序，显著提升了预测成功率，而无需穷举采样。该研究表明，浅层设计的MSAs足以提供足够的界面信息，使AlphaFold聚焦于目标结合模式，从而高效且准确地建模具有挑战性的环介导蛋白质-蛋白质相互作用，为蛋白质设计评估和结构预测提供了实用工具。

关键技术与方法

1. 1.
   ProteinMPNN界面设计生成合成MSAs：研究人员利用ProteinMPNN这一固定主链序列设计方法，在给定复合物结构模型上，固定非界面残基，仅允许突变结合界面上的残基，快速生成100条序列变体，构成一个浅层的配对合成MSA，模拟天然复合物的共进化耦合信号。
2. 2.
   MSA Transformer接触预测：为验证设计MSAs是否编码了界面接触信息，研究人员使用MSA Transformer从这些浅层合成MSAs中预测链间接触，并与晶体结构的接触图谱比较，评估预测精度。
3. 3.
   AlphaFold2-Multimer（AFM）与AlphaFold3（AF3）结构预测：将设计MSAs作为定制输入，分别替代或补充AFM和AF3默认的序列搜索流程，进行结构预测。对于AF3，还评估了不同种子采样深度（1个与100个）的影响。
4. 4.
   结构质量评估指标：采用L-RMSD（配体均方根偏差）、DockQ（基于CAPRI标准的对接质量评分）、pLDDT（局部结构预测可信度）、ipTM（界面预测模板建模得分）以及综合得分（CS = 界面pLDDT × ipTM × 归一化L-RMSD）等指标全面评估预测的结构准确性和置信度。
5. 5.
   盲结构预测优化流程：针对默认AF3预测中顶层模型ipTM≤0.5的低置信度案例，将所有种子模型按DockQ≥0.49进行聚类，选取代表性结构，对其使用AF3(1)-MPNN（单个种子）进行优化，最后根据更新后的ipTM对所有预测进行重新排序。

研究结果

2.1 设计MSAs编码来自结构模型的蛋白质-蛋白质界面信息

研究人员证实，通过ProteinMPNN从93个纳米抗体-抗原晶体复合物生成的浅层设计MSAs，经MSA Transformer预测的界面接触具有较高精度。在8 ?和10 ?距离阈值下，平均前10位接触精度分别达到47%和73%，表明这些MSAs编码了足够精细和粗粒度的界面信息，可用于引导结构预测。

2.2 设计MSAs改进了基于AlphaFold的实验确定复合物评估

在两个独立的纳米抗体-抗原数据集上，相比于默认方法，AFM-MPNN和AF3-MPNN（使用设计MSAs）显著提升了复合物预测质量。在数据集1中，AFM-MPNN、AF3(1)-MPNN和AF3(100)-MPNN达到中等或高等DockQ质量的比例分别为86%、88%和93%，而默认方法仅为29%、62%和70%。改进主要体现在默认方法预测错误的复合物上，不仅恢复了正确的对接方向，还显著提高了CDR环（尤其是CDR H3）的构象精度至亚埃级。同时，设计MSAs减少了AF3对大量种子采样的依赖，性能在20个种子内即可收敛。

2.3 设计MSA评估方法泛化至抗体和单克隆抗体复合物

在包含49个Fv-抗原复合物的抗体数据集和35个单克隆抗体-抗原复合物数据集中，设计MSAs同样带来了显著的预测改进。例如，抗体数据集中，AFM-MPNN、AF3(1)-MPNN和AF3(100)-MPNN达到中等或高等DockQ的比例分别从21%、38%和57%提升至75%、69%和93%，证明了该方法对不同免疫球蛋白样支架的普适性。

2.4 设计MSAs能够区分结合与非结合界面

通过对纳米抗体进行多种扰动实验，包括随机突变界面残基、替换整个CDR H3环、与非同源抗原配对以及使用不同质量的解耦模型生成MSAs，研究人员发现AF3-MPNN预测仅在序列和结构与设计MSAs编码的界面兼容时才产生高置信度和准确的结果。任何不兼容的扰动都会导致预测置信度和结构准确性显著下降，证明该方法并非简单地偏向输入模型，而是具备真实的界面判别能力。

2.5 设计MSAs能够实现蛋白质-蛋白质复合物模型的优化

从251个不同质量等级的解耦模型出发，AF3-MPNN预测普遍改善了对接准确性，表现为DockQ升高和ipTM增加。高质量模型得以保持，中等质量模型常得到改进，而一些初始错误的模型甚至能收敛到近天然结构。这表明设计MSAs能够放大部分准确模型中残留的天然界面接触信息，引导AlphaFold向更优构象优化。

2.6 应用于盲结构预测：AlphaFold模型的靶向优化与重排序

针对78个后AF3训练截止日期的抗体和纳米抗体-抗原复合物，研究人员对其中27个默认AF3(100)顶层模型ipTM≤0.5的低置信度案例应用了优化与重排序流程。该流程将总体成功率（顶层模型达到可接受及以上DockQ质量的比例）从22.2%提升至48.1%，其中9个最初错误的预测被优化为中等到高质量的对接模型。该改进归功于设计MSAs的引导，而非额外的种子采样。

讨论与结论

本研究表明，可以通过工程化的MSAs来编码蛋白质-蛋白质界面信息，并引导AlphaFold对环介导相互作用的预测。该框架兼具评估和优化功能：对兼容界面产生高置信度预测，对不兼容界面则给出低置信度或结构不一致的结果，从而有效判别模型优劣；同时，从部分准确结构出发，可引导AlphaFold向更优构象进行优化。在盲结构预测中，通过优化代表性结构簇并重新排序，显著提升了低置信度情况下的预测性能，且仅需适度增加计算成本。该方法计算高效，因为ProteinMPNN可在数秒内生成所需MSAs，且设计MSAs能使AF3的采样在20个种子内收敛，大大降低了对大量种子采样的依赖。此外，AFM-MPNN与AF3(1)-MPNN表现相当，鉴于AFM的开源和易用性，这扩展了其在免疫球蛋白样相互作用建模中的实用性。尽管本研究聚焦于环介导相互作用，但该策略有望推广至其他具有挑战性的异源复合物预测。未来研究可探索增加序列数量、调整采样温度或使用替代设计方法来进一步提升性能。由于MSAs是现代蛋白质结构预测方法的标准输入，这一策略易于迁移至未来的MSA框架，为下一代蛋白质建模和设计管线提供了一种整合结构假设的简便机制。

研究结论翻译

研究人员证明了MSAs可以被工程化以编码蛋白质-蛋白质界面信息，并引导AlphaFold对环介导相互作用的预测。通过使用ProteinMPNN设计MSAs，研究人员建立了一个既可评估又可优化蛋白质-蛋白质复合物模型的框架。设计MSAs对兼容界面产生可信、准确的预测，同时对不兼容界面产生低置信度或结构不一致的预测，从而实现了正确与错误模型之间的判别。当从部分准确的结构生成时，它们还能引导AlphaFold朝向改进的构象，从而实现蛋白质-蛋白质复合物的优化。