《Oncogene》：PDGF-BB and bFGF repress Kai1 in pericytes through Src–DNMT-associated promoter methylation and lysosomal trafficking
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肿瘤血管生成（tumor angiogenesis）的维持不仅依赖于内皮细胞（endothelial cell）激活，还依赖于血管周围微环境（perivascular niche）的适应性重编程（adaptive reprogramming）。四跨膜蛋白（te
肿瘤血管生成（tumor angiogenesis）的维持不仅依赖于内皮细胞（endothelial cell）激活，还依赖于血管周围微环境（perivascular niche）的适应性重编程（adaptive reprogramming）。四跨膜蛋白（tetraspanin）Kai1（CD82）作为周细胞（pericyte）内在的抗血管生成激活抑制因子，但其在血管生成肿瘤微环境中丢失的机制仍不清楚。研究人员证明，血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），而非血管内皮生长因子-A（VEGF-A），在小鼠周细胞样模型（pericyte-like model）中降低Kai1表达。机制上，PDGFR（血小板衍生生长因子受体）/FGFR（成纤维细胞生长因子受体）信号与双层调控程序（dual-layer regulatory program）相关：（1）Src敏感的DNA甲基转移酶1（DNMT1）和DNA甲基转移酶3A（DNMT3A）增加与Kai1启动子（promoter）甲基化增加及转录减少相关；（2）PKC（蛋白激酶C）敏感的、Flotillin-1相关的运输（trafficking）促进Kai1内吞（internalization）和溶酶体降解（lysosomal degradation）。功能上，DNMT抑制或溶酶体阻断可恢复Kai1水平并减弱生长因子诱导的三维球体（3D spheroid）出芽（sprout outgrowth）。体内（in vivo），联合DNMT和溶酶体抑制减少野生型（WT）小鼠肿瘤生长，而在Kai1敲除（Kai1 KO）小鼠中未观察到类似降低。总之，这些发现确定了一个生长因子编程的“关闭开关”（off-switch），禁用了周细胞内在的抗血管生成制动。这些发现将周细胞Kai1调控提名为一个潜在机制，值得未来在VEGF非依赖性血管重塑（VEGF-independent vascular remodeling）中研究。
血管生成是肿瘤生长、播散与治疗耐药的基础。尽管芽生血管生成（sprouting angiogenesis）常围绕VEGF和FGF介导的内皮激活展开，但其实际受多细胞血管生态位调控，其中周细胞（pericyte）通过限制内皮增殖与通透性、促进细胞外基质沉积来维持血管稳定。周细胞维持血管完整性，其募集依赖内皮来源的PDGF-B；内皮-壁细胞通讯中断则产生不规整、渗漏的血管，促进转移与治疗耐药。肿瘤还可在VEGF靶向干预期间利用壁细胞程序，使周细胞在静息与重塑许可状态间转换以响应微环境信号。Kai1（CD82）是一种四跨膜蛋白（tetraspanin）metastasis suppressor，既往研究显示其在骨髓造血干细胞中通过TGFβ1通路维持静息；在血管生态位中，周细胞表达的Kai1作为内源性抗血管生成调节因子，使局部微环境趋向血管静息。然而，在持续血管生成信号强化的肿瘤微环境中，这一抗血管生成制动如何被解除仍不清楚。肿瘤产生PDGF-BB和bFGF等因子协同促进新生血管与周细胞募集，阐明其如何重编程周细胞内在抑制模块对理解VEGF非依赖性重塑至关重要。此外，慢性肿瘤信号可能需表观遗传锁定机制维持重塑许可状态，而Kai1作为膜组织蛋白是否通过翻译后机制被快速清除亦属未知。基于此，研究人员系统研究了血管生成刺激下周细胞Kai1下调的分子机制。
为解析上述问题，研究人员以小鼠周细胞样细胞系10T1/2为主要模型，结合原代人脑血管周细胞及内皮细胞系MS-1，系统检测了PDGF-BB、bFGF和VEGF-A对Kai1的调控效应。通过药理学抑制、siRNA敲低、亚硫酸氢盐测序、免疫荧光、蛋白质免疫印迹及三维球体出芽实验，研究人员发现PDGF-BB和bFGF通过双重机制抑制周细胞Kai1：一是Src-DNMT相关通路增加Kai1启动子甲基化从而抑制转录；二是PKC-Flotillin-1相关内吞运输促进Kai1溶酶体降解。体内实验进一步证实，DNMT抑制剂与溶酶体抑制剂联合使用可抑制野生型小鼠肿瘤生长及血管化，但在Kai1敲除小鼠中该效应消失。该研究揭示了肿瘤微环境解除周细胞抗血管生成制动的具体机制，为理解VEGF非依赖性血管重塑及开发靶向基质细胞表观遗传与运输途径的治疗策略提供了理论依据。
研究人员主要采用以下关键技术方法：以小鼠周细胞样细胞系10T1/2、内皮细胞系MS-1及原代人脑血管周细胞为模型，利用定量逆转录PCR（qRT-PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）及免疫荧光（immunofluorescence）检测Kai1表达与定位；运用流式细胞术分析受体表达谱；通过亚硫酸氢盐测序检测Kai1启动子CpG岛（CpG island）甲基化；借助siRNA（小干扰RNA）敲低及小分子抑制剂（如PP2、G?6983、5-azacytidine、E64-d）解析信号通路；利用抗体内化实验结合共聚焦成像追踪Kai1内吞及内体-溶酶体转运；通过MS-1、10T1/2与B16混合三维球体（3D spheroid）模型评估血管出芽；并构建野生型（WT）与Kai1敲除（Kai1 KO）小鼠皮下移植瘤模型进行局部药物抑制实验。此外，研究人员重新分析了公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（GSE112302胃癌、GSE176031前列腺癌、GSE132465结直肠癌），并结合人胃癌与前列腺癌组织多重免疫荧光加以验证。
人肿瘤周细胞中Kai1表达降低及Kai1-low周细胞与血管重塑程序相关
对胃癌和前列腺癌组织的免疫荧光显示，肿瘤NG2（神经元-神经胶质抗原2）阳性区域Kai1信号较正常组织显著降低。跨三个独立scRNA-seq数据集的再分析表明，在前列腺癌、胃癌和结直肠癌队列中，Kai1-low周细胞均一致富集血管生成、血管发育及血管重塑相关转录程序。
PDGF-BB和bFGF而非VEGF-A下调周细胞样细胞中的Kai1
10T1/2细胞中，PDGF-BB和bFGF时间依赖性降低Kai1 mRNA与蛋白，而VEGF-A无显著效应。流式细胞术显示10T1/2细胞高表达PDGFRA、PDGFRB及FGFR1，而VEGFR2主要富集于内皮细胞。原代人脑血管周细胞中联合PDGF-BB与bFGF同样抑制Kai1。受体阻断实验证实PDGFR和FGFR信号分别介导PDGF-BB和bFGF诱导的Kai1下调。
Src和PKC相关信号通路差异性地影响Kai1转录本与蛋白水平
Src抑制剂PP2恢复生长因子处理后Kai1的mRNA和蛋白水平，而PKC抑制剂G?6983仅恢复蛋白水平，对转录本无明显影响。Akt和ERK抑制对Kai1水平无显著作用，提示Src通路主要参与转录抑制，PKC通路主要参与翻译后调控。
血管生成因子诱导的Kai1转录抑制与Src敏感的DNMT上调及启动子甲基化增加相关
PDGF-BB与bFGF增加DNMT1和DNMT3A蛋白水平，Src抑制可阻断该效应。亚硫酸氢盐测序证实生长因子增加Kai1启动子CpG岛甲基化，Src抑制则降低甲基化。DNMT抑制剂5-azacytidine恢复Kai1 mRNA及蛋白水平，表明Src-DNMT相关通路通过启动子甲基化导致Kai1转录沉默。
PKC/Flotillin-1相关运输促进Kai1内吞并导向内体-溶酶体途径
配体洗脱后Kai1蛋白迅速恢复而mRNA仍维持低水平。siRNA敲低显示敲低Flotillin-1（而非Clathrin重链或Caveolin-1）阻断Kai1蛋白下降。抗体内化实验证实PDGF-BB与bFGF促进Kai1内吞，依赖Flotillin-1且被PKC抑制逆转。共聚焦成像显示Kai1与Flotillin-1共定位增加，并随时间从EEA1（早期内体抗原1）阳性早期内体向LAMP2（溶酶体相关膜蛋白2）阳性溶酶体转位。溶酶体抑制剂E64-d比蛋白酶体抑制剂MG132更有效地恢复Kai1水平，表明Kai1主要通过溶酶体途径降解。
DNMT和溶酶体抑制与体外出芽减少及体内肿瘤生长和血管化降低相关
三维球体模型中，PDGF-BB与bFGF促进CD31阳性出芽，5-azacytidine与E64-d减弱该效应。WT小鼠局部联合给予5-azacytidine与E64-d显著降低肿瘤体积及CD31阳性血管密度；Kai1 KO小鼠中该效应消失，提示体内效应依赖Kai1。
讨论部分指出，PDGF-BB和bFGF通过互补的转录与翻译后机制抑制周细胞Kai1。研究提出“快与慢”双层调控模型：PKC-Flotillin-1相关溶酶体运输可快速清除预存Kai1蛋白，而Src-DNMT相关启动子甲基化则在持续血管生成刺激期间限制Kai1再表达，从而维持周细胞重塑许可状态。人组织学与跨队列scRNA-seq分析支持周细胞Kai1抑制与血管生成输出之间的关联。内皮细胞Kai1研究提示其在病理性血管生成中的上下文依赖作用，本研究则将此框架延伸至周细胞，显示血管生成生长因子通过明确信号通路主动抑制周细胞Kai1，可能与VEGF非依赖性血管重塑相关。然而，由于使用全身性Kai1 KO小鼠，体内效应不能特异归因于周细胞来源Kai1。此外，Src-DNMT轴将细胞外血管生成信号与基质细胞表观遗传调控相联系，提示表观遗传药物可能影响基质血管程序；PKC-Flotillin轴则通过非网格蛋白内吞途径促进Kai1快速移除，从而允许更具重塑许可性的周细胞状态。由于研究未考察抗VEGF治疗或耐药模型，数据尚未建立Kai1通路调控可克服常规抗血管生成治疗耐药。结论：PDGF-BB和bFGF通过Src-DNMT相关启动子甲基化和PKC/Flotillin相关溶酶体降解抑制周细胞Kai1。这些发现推进了对肿瘤相关生长因子信号如何调控基质血管状态的理解，并将周细胞Kai1调控鉴定为VEGF非依赖性血管重塑中值得进一步研究的通路。
