《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：NBD-F derivatization and rapid separation of catecholamines and their O-methylated metabolites using flow-gated micellar electrokinetic chromatography
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儿茶酚胺（catecholamines）作为神经递质和激素在脑及交感神经系统中发挥功能。对这些化合物的测定在神经科学研究、临床诊断和药物开发中具有重要意义。其O-甲基化代谢产物，尤其是3-甲氧基肾上腺素（metanephrine, MN）和去甲变肾上腺素（no
儿茶酚胺（catecholamines）作为神经递质和激素在脑及交感神经系统中发挥功能。对这些化合物的测定在神经科学研究、临床诊断和药物开发中具有重要意义。其O-甲基化代谢产物，尤其是3-甲氧基肾上腺素（metanephrine, MN）和去甲变肾上腺素（normetanephrine, NMN），已被确立为嗜铬细胞瘤（pheochromocytomas）和副神经节瘤（paragangliomas）生化评估的成熟生物标志物。本研究旨在评价4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑（4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole, NBD-F）作为荧光衍生试剂，采用流动门控毛细管电泳（capillary electrophoresis, CE）实现此类化合物的快速分离与灵敏检测的潜力。研究结果表明，当NBD-F过量存在时，NBD-F易与儿茶酚胺的氨基及酚羟基发生反应，生成完全NBD取代的衍生物——三-NBD取代产物（tri-NBD derivatives）；类似地，儿茶酚胺的O-甲基化代谢产物也被完全NBD取代，形成二-NBD取代产物（di-NBD derivatives）。这些衍生物通过胶束电动色谱（micellar electrokinetic chromatography, MEKC）在80秒内实现分离。十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）存在于样品溶液中时可能促进儿茶酚胺的衍生化反应，而分离缓冲液中的SDS则可增强衍生物的荧光强度。检测限（limits of detection, LODs）测定结果显示，多巴胺（dopamine）为1.7 nM，去甲肾上腺素（norepinephrine）为1.3 nM，与先前报道的MEKC/NBD-Cl法所获检测限相比改善约80倍。该方法进一步应用于尿液和脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）样品分析，以验证其适用性。上述结果表明，NBD-F/MEKC联用策略作为儿茶酚胺及其代谢产物的高灵敏、快速分析方法以及神经科学研究的实用生化工具具有应用潜力。
**研究背景与意义**
儿茶酚胺，包括多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）和肾上腺素（E），在广泛的生理过程中发挥关键作用。静息条件下，儿茶酚胺浓度在血液和组织中维持在相对狭窄的生理范围内，其异常升高或降低可能与神经系统疾病及其他健康相关障碍相关联。无论浓度如何，儿茶酚胺均持续经历生化代谢，产生O-甲基化代谢产物及其他降解产物。因此，对脑脊液（CSF）、尿液及血液血浆等生物流体中儿茶酚胺及其O-甲基化代谢产物的测量，对生物医学研究与临床诊断至关重要。其中O-甲基化代谢产物（MN和NMN）是嗜铬细胞瘤和副神经节瘤生化评估的成熟生物标志物。
当前检测技术多依赖高效液相色谱（HPLC）与电化学检测（HPLC-EC）或串联质谱（HPLC-MS/MS）联用，但二者均需大量样品制备且色谱分离耗时较长；免疫测定与放射化学技术则受限于交叉反应、分析复杂性及准确性有限等问题。尽管毛细管电泳（CE）与激光诱导荧光（LIF）检测联用已用于体内多巴胺监测，但检测灵敏度仍有提升空间。NBD-F作为荧光衍生试剂颇具前景，因其可与伯胺和仲胺反应，能实现对含仲氨基的肾上腺素及其代谢产物MN的衍生化，而萘二甲醛（NDA）等试剂仅能衍生伯胺。然而，NBD-F衍生化产物的结构表征提示儿茶酚胺可在三个反应位点（一个氨基和两个酚羟基）发生完全三-NBD取代，该衍生化过程较既往认知更为复杂，所得衍生物在毛细管电泳中的行为亟待深入探究。
**研究方法概述**
研究人员采用实验室自建的流动门控毛细管电泳（flow-gated CE）系统，配备465 nm二极管激光器、100×油浸物镜及光电倍增管（PMT）检测。关键技术方法包括：（1）NBD-F荧光衍生化技术，通过亲核芳香取代（SNAr）反应使NBD基团共价连接至氨基与酚羟基；（2）胶束电动色谱（MEKC）分离技术，以SDS胶束为假固定相、乙腈（ACN）为有机改性剂；（3）流动门控电动进样技术，实现纳升级快速进样与80秒内高速分离；（4）激光诱导荧光（LIF）检测。样品来源为成年男性捐献的尿液及Sprague Dawley大鼠混合脑脊液（CSF）。
**研究结果**
**NBD-F与NBD-Cl衍生物的比较**：研究人员分别采用NBD-F与NBD-Cl对DANE进行衍生化，经流动门控CE分析，NBD-F衍生物的迁移时间与NBD-Cl衍生物完全吻合，混合分析后每种化合物仅呈现单一峰，无额外或分离峰，表明两种试剂产生相同的主要荧光衍生物，尽管其反应动力学不同。
**儿茶酚胺三-NBD取代的间接证据**：在含40 mM SDS的背景电解质（BGE）中，三种儿茶酚胺及其O-甲基化代谢产物的六种衍生物获得基线分离。迁移行为分析显示O-甲基化代谢产物衍生物迁移速度快于其母体化合物，提示引入的NBD基数目不同。进一步以DA、3-MT（单-O-甲基化类似物）与DMPEA（二-O-甲基化类似物）混合衍生证实，单-NBD取代的DMPEA迁移远快于二-NBD取代的3-MT与三-NBD取代的DA，间接证明DA侧链氨基及芳香环上可用酚羟基位点实现完全NBD取代；NE、E、NMN与MN的相对迁移行为与多巴胺系列一致，间接支持NE和E主要形成三-NBD取代产物而其O-甲基化代谢产物主要形成二-NBD取代产物。
**NBD-F限量条件下的衍生化**：当DA或NE过量（1.0 mM对0.1 mM NBD-F）时，除三-NBD衍生物峰与空白峰外出现少量额外峰，暂归因于单-NBD或二-NBD取代产物但证据不足以区分。荧光响应比较表明三-NBD取代产物仅占初始NBD-F的约15%，提示大部分NBD-F经水解为NBD-OH或形成低取代度产物。时间进程实验显示三-NBD取代DA峰于前约27分钟上升后下降，表明产物在pH 9.2下不稳定，NE衍生物稳定性更差。
**分离与信号增强的背景电解质条件**：不含SDS时DANE衍生物峰无法清晰识别；低至5 mM SDS即可实现分离但峰形宽矮（低于临界胶束浓度，CMC）；20和40 mM SDS时峰高增加、峰宽变窄，证实SDS可增强NBD衍生物荧光强度。因衍生物高度疏水而强分配入胶束导致共迁移，添加10% (v/v) ACN可改变分配行为实现分离，同时避免过度抑制电渗流（EOF）延长分析时间。
**DANE衍生化条件优化**：高浓度硼酸盐使衍生物峰高降低，选定40 mM硼酸盐（相当于10 mM四硼酸盐）；pH 7.8在衍生化动力学与衍生物稳定性间取得平衡；30% ACN（v/v）兼顾溶解度与进样可行性；20或40 mM SDS使DA衍生物峰高显著增加，提示SDS可促进反应或协助保存荧光衍生物，并将所需ACN比例由50%降至30%。
**分析性能**：直接衍生5.0 nM DANE测得LOD为NE 1.3 nM、DA 1.7 nM，与既往MEKC/NBD-Cl法相比改善约80倍，较非水相MEKC/NBD-Cl法提高逾10倍。5–100 nM范围内线性良好（R2>0.99），归一化峰响应的相对标准偏差（RSD）一般为1–7%。分离效率优异，理论塔板数（N）一般超过2.0×10
5，相邻峰电泳分辨率（Rs）一般大于1.8。
**尿液和脑脊液样品分析**：CSF中多数主要峰获得分离，但DA峰被NBD-F相关未知大峰部分掩盖，标准添加25 nM后方显现肩峰；尿液中儿茶酚胺浓度更高，但MN与synephrine、3-MT与tyramine因二-NBD取代衍生物结构相似（仅甲氧基有无之差）而无法解析，NMN与octopamine则可分离，提示需进一步优化条件方能可靠测定尿液中的O-甲基化代谢产物。
**讨论与结论**
本研究通过流动门控CE系统上的MEKC考察了NBD-F对儿茶酚胺及其O-甲基化代谢产物的衍生化行为，间接证实氨基与酚羟基均具反应活性，每个分子可连接多个NBD基团。衍生物高度疏水，虽为分析带来挑战，却可利用与SDS的疏水相互作用改善分离与LIF检测灵敏度；高pH下稳定性虽下降，但在pH 8.0以下受控条件下可保持相对稳定。基于优化方案，六种NBD-F衍生物在80秒内成功实现MEKC分离，LOD达超纳摩尔级，据研究人员所知，鲜有CE-LIF方法能在分析物覆盖范围、分离速度与检测灵敏度三者组合上与之比拟，对体积受限的CSF样品分析尤具意义。CSF与尿液直接分析中残留的干扰问题（酪胺与3-MT共迁移、MN与synephrine共迁移、NBD-F相关背景峰干扰DA）有待未来通过MEKC条件进一步优化与灵敏度提升予以解决，以推动此类化合物在神经科学研究及嗜铬细胞瘤、副神经节瘤等疾病的生化评估中的应用。
