GPCR–Gustducin复合物的功能多样性调控信号输出并抑制旁路信号通路

《Nature Communications》：Functional diversity of GPCR–Gustducin complexes controls signaling output and suppresses alternative pathways

味觉转导蛋白（Ggust）是介导味觉受体信号转导的G蛋白，不仅表达于感觉味觉细胞，还与众多非味觉G蛋白偶联受体（GPCRs）共同表达于人体全身。这些受体是否以及如何与Ggust结合，及其相互作用的功能后果，目前仍知之甚少。本研究开发了两种互补的生物传感器，可在活细胞中直接监测GPCR–Ggust相互作用及下游信号转导，从而对非味觉GPCRs诱导的Ggust活性进行药理学表征。研究发现，若干非味觉GPCRs并不激活Ggust，而是通过形成非生产性GPCR–G蛋白复合物稳定G蛋白异源三聚体并抑制基础信号；而另一些受体则诱导常规的Ggust激活与信号转导。研究进一步表明，这些非生产性GPCR–Ggust复合物通过将受体从其他G蛋白处隔离，抑制旁路信号通路的激活。这种相互作用模式在功能上将GPCRs划分为Ggust的激活剂与失活剂，代表了细胞内平衡并行信号通路的一种机制。

研究背景：味觉转导蛋白Gα_gust（由GNAT3编码）属于G_i/o家族G蛋白，是G_gust异源三聚体（Gα_gustβγ）的主要组分，在味觉感知中通过偶联苦味受体（TAS2Rs）和甜/鲜味受体（TAS1Rs）发挥核心作用。除舌和腭的II型味觉受体细胞外，Gα_gust还表达于胃、小肠和结肠的特化上皮细胞，将味觉受体与胰高血糖素样肽1（GLP-1）分泌、ghrelin释放及钠依赖性葡萄糖转运体1（SGLT1）表达联系起来。单细胞与单核测序技术揭示，Gα_gust在人体内还可与非味觉受体共表达：人类蛋白质图谱报道其在脑、睾丸、脂肪组织以及十二指肠和小肠其他部位高水平表达，这些组织同时表达大量非味觉GPCRs。然而，G_gust能否偶联并介导这些受体的信号转导尚不清楚，这一知识空白即为本研究的出发点。

研究人员采用整合性策略，将单细胞表达数据分析与所开发的通路无偏性G_gust激活传感器及Gα_gust介导信号转导传感器相结合。研究发现，若干非味觉GPCRs可与含Gα_gust的异源三聚体偶联，且这种偶联产生两类功能上截然不同的复合物：一类是促进G_gust激活的常规信号复合物，如与A₁腺苷受体（A₁R）和组胺H₃受体（H₃R）形成的复合物；另一类是抑制基础Gα_gust信号转导的复合物，如与组胺H₂受体（H₂R）或A_2A腺苷受体（A_2AR）形成的复合物。核苷酸敏感性实验证实了这些GPCR–G_gust相互作用，提示G_gust可能通过响应非味觉受体配体来调节胃肠道生理功能的机制。该研究的意义在于将G_gust鉴定为广泛相互作用的G_i/o家族成员，其信号输出可被非味觉GPCRs增强或抑制，并可作为旁路信号通路的限定因素，为理解细胞内并行信号通路的平衡提供了新机制。

关键技术方法：研究主要采用基于生物发光共振能量转移（BRET）的活细胞传感技术：一是G_gust异源三聚体解离传感器Ggust-CASE（以NanoLuciferase标记Gα_gust、cpVenus标记Gγ₉），并衍生出dark及double dark版本；二是Gα_gust–PDE6γ蛋白相互作用传感器，用于监测Gα_gust介导的信号转导；三是受体–G蛋白复合物核苷酸敏感性BRET分析（受体-Nluc与Venus-Gβ₁γ₂）及Gβγ释放实验；此外结合细胞透化与核苷酸耗竭（apyrase/digitonin、GDPβS/GTPγS）技术、cAMP GloSensor检测、β-arrestin2转位实验及HiBiT表面表达定量。细胞模型为HEK-293A细胞及内源性Gα缺陷型HEK-293A细胞（由Asuka Inoue提供），并基于人类蛋白质图谱与公开单细胞RNA测序数据完成共表达分析。

研究结果：

G_gust异源三聚体解离生物传感器：研究人员将NanoLuciferase（Nluc）融合至Gα_gust的Asp116位点，与野生型Gβ₃及N端标记cpVenus的Gγ₉共表达，构建Ggust-CASE，并制备dark Ggust-CASE（cpVenus Y218W）与double dark Ggust-CASE（Nluc R164Q）。刺激共表达的味觉受体Tas2R14（氟芬那酸）或H₃R（组胺）引起浓度依赖性BRET下降，pEC₅₀分别为4.62±0.15与7.24±0.23，与既往报道一致，验证了传感器功能。

Gα_gust介导信号转导的生物传感器：研究人员以分子间BRET将cpVenus/YFP标记的多种Gα效应蛋白与Gα-Nluc组合筛选，发现Gα_gust-Nluc与C1结构域标记的AC5及Gα_i/o(GTP)检测器KB1753仅有微弱响应，且G_gust激活不改变细胞内cAMP水平。基于文献线索，研究人员建立Gα_gust-Nluc与cpVenus-PDE6γ相互作用分析，组胺诱导约10%的BRET升高，pEC₅₀=7.92±0.07，效价较KB1753读出高500倍以上，Gα_q-Nluc/H₁R阴性对照无显著变化，表明Gα_gust与PDE6γ的相互作用增强可作为其信号转导读出。

G_gust异源三聚体中GPCR特异的构象响应：基于人类蛋白质图谱，研究人员在十二指肠与小肠中鉴定出202与201个与Gα_gust（GNAT3）共表达的GPCRs，从中选取25个药理学可及的受体（覆盖四大Gα家族）并纳入H₃R，共26个。单细胞共表达分析确认全部26个受体均与GNAT3共表达，其中14个在胃肠道或附属消化组织细胞中共表达，23个在脑细胞中共表达。在Ggust-CASE药理学测试中，11个受体不介导BRET变化（非G_gust偶联者），13个介导浓度依赖性BRET变化；其中部分受体（如A₁R）引起BRET下降，而H₂R等引起BRET升高。所有引起BRET下降的受体此前均被证明可激活G_i/o家族G蛋白。masGRK3ct-Nluc/Venus-Gβγ实验证实H₂R与A_2AR不诱导Gβγ释放；透化与核苷酸耗竭实验显示GTPγS引起Ggust-CASE BRET浓度依赖性下降（EC₅₀=3.7 μM），表明G_gust在完整细胞中具有基础活性。

G_gust与PDE6的相互作用可被GPCR介导的激活增强或减弱：研究人员以dark Ggust-CASE与PDE6γ-cpVenus检测三类受体的效应，发现引起Ggust-CASE BRET升高的受体（C组）降低Gα_gust与PDE6γ的相互作用，反之亦然，提示激动剂激活前已存在基础相互作用，且这些受体激活使G_gust活性向失活状态偏移。在GDPβS预载细胞中加入GTPγS可增强Gα_gust与PDE6γ的BRET，证实完整细胞中两者在GPCR激活前即已相互作用。

核苷酸敏感性实验揭示生产性与非生产性GPCR–G_gust复合物：研究人员将C端Nluc标记受体与Venus-Gβ₁γ₂及野生型Gα_gust共表达于内源性Gα缺陷细胞。GTPγS使H₃R与A₁R的受体–G_gust复合物解离，BK₂R呈先重排后解离的两相反应；而A_2AR、H₂R与5HT_1AR则表现为复合物形成增强或重排。百日咳毒素（PTX）实验显示，A₁R经Ggust-CASE引起的BRET变化被PTX阻断，而H₂R介导的BRET升高对PTX不敏感，提示非生产性H₂R–G_gust复合物不依赖Gα_gust α5螺旋与受体跨膜核心的相互作用。

非生产性GPCR–G_gust复合物将受体从其他G蛋白处隔离：研究人员以double dark Ggust-CASE过表达评估其对其他G蛋白激活及β-arrestin2招募的影响。生产性G_gust偶联者（A₁R、H₃R、D₂R、APLNR）对原发与继发G蛋白的激活未受损害；而非生产性偶联者（H₂R、A_2AR、5HT_1AR、GPBAR）介导的G蛋白激活幅度显著降低，G_s激活的抑制直接转化为组成型及配体诱导的cAMP生成减少；无受体共表达时G_gust过表达不影响cAMP水平。β-arrestin2向质膜转位实验同样显示旁路通路受抑，且H₂R表面表达水平在有无double dark Ggust-CASE共表达时相似。综合结果表明，非生产性GPCR–G_gust复合物将受体从其他G蛋白隔离，削弱其激活，减少Gβγ释放，限制GRK招募，进而降低β-arrestin与磷酸化受体的结合。

讨论部分总结：许多GPCRs可偶联并激活不止一种G蛋白，而不同GPCRs以不同方向调节G蛋白活性的可能性近年才因非生产性GPCR–G蛋白结合的报道而受到关注。本研究显示G_gust在HEK-293A细胞中可与若干非味觉GPCRs偶联并受其调控，多个受体降低基础G_gust活性与信号转导，补充了非生产性GPCR–G蛋白复合物的近期报道。研究提出G_gust在细胞中作为GPCR调控的双模式决定因素：其与GPCR的相互作用既可为生产性（增强信号转导），也可为非生产性（降低基础G_gust依赖信号并抑制旁路信号通路激活）。既往共表达分析提示G_gust可能在胰腺β细胞和结肠中偶联非味觉GPCRs以促进GLP-1释放和胰岛素分泌等生理反应，但此前缺乏直接证据。基础Gα_gust信号活性对维持胰腺β细胞低cAMP水平与低胰岛素分泌、以及味蕾低Ca²⁺信号具有重要生理意义；生产性与非生产性GPCRs偶联G_gust可在额外外部刺激前调节细胞敏感性，G_gust介导的受体隔离也可能作为防止同一细胞内并行信号通路同时激活的生理机制。研究同时指出局限性与待解问题：实验在过表达系统中完成，受体与G蛋白的相对丰度可能不同于天然组织，需在更接近生理的系统中进一步验证；界定GPCR为G_gust生产性或非生产性伙伴的分子/原子层面决定因素尚待确定，26个GPCRs的谱系分析未发现非生产性偶联与四大G蛋白家族原发偶联偏好之间的显著相关性，提示存在偶联偏好之外的决定因素；尽管G₁₂的非生产性偶联受Gα₁₂ C端α5螺旋影响，但G_i1与G_o1在C端区域高度相似的情况下仍与H₂R形成生产性复合物，提示其他区域也影响受体结合后G_gust的信号能力。结构研究与突变图谱分析有望提供机制见解并开辟靶向这些相互作用的途径。

研究结论翻译：综上，本研究将G蛋白G_gust鉴定为一个广泛相互作用的G_i/o家族成员，其信号输出可被非味觉GPCRs增强或抑制，并可作为旁路信号通路的限定因素。未来需结合突变分析、结构方法与天然细胞系统实验，以确定此处揭示的调控原理是否在体内参与营养感知与激素分泌等生理过程。