微生物肽聚糖（Peptidoglycan, PGN）经结合自噬衔接蛋白p62（SQSTM1）激活肝细胞线粒体自噬（Mitophagy）缓解肝纤维化

《EMBO Molecular Medicine》：Microbial peptidoglycan activates mitophagy via binding autophagy adaptor p62 to reduce liver fibrosis

　　

线粒体自噬（mitophagy）对维持线粒体完整性与肝脏稳态至关重要，然而调控该过程的具体微生物信号仍不明确。研究人员鉴定出细菌肽聚糖（peptidoglycan, PGN）——细菌细胞壁中普遍存在的一种成分——作为一种可激活肝细胞线粒体自噬并保护机体免受肝纤维化危害的微生物信号。PGN被肝细胞摄取并与线粒体结合，进而与自噬衔接蛋白p62（SQSTM1）相互作用以启动线粒体自噬。肝细胞特异性缺失p62完全消除了PGN诱导的线粒体自噬，确立p62为这一微生物反应不可或缺的介导因子。在功能层面，PGN诱导的线粒体自噬在体外和体内均可保护肝细胞免于药物诱导的细胞死亡；PGN给药可减少CCl₄诱导的肝纤维化模型中的胶原沉积与肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）激活。这些发现揭示了细菌细胞壁成分与肝细胞线粒体质量控制之间直接的功能联系，揭示了一条此前未被认识的肠道微生物-线粒体自噬轴。因此，PGN介导的肝细胞线粒体自噬激活代表了一种恢复线粒体稳态并限制纤维化肝损伤的潜在策略。

**研究背景与科学问题**

肝纤维化是慢性肝损伤的共同结局，可进展为肝硬化与肝衰竭，目前直接保护肝细胞稳态、阻止纤维化进展的策略有限。线粒体功能障碍是多种病因肝损伤的标志：受损线粒体积累活性氧（reactive oxygen species, ROS）与细胞色素c等促凋亡因子，ATP生成受损，破坏细胞稳态并加剧肝细胞损伤与死亡。线粒体自噬（mitophagy）作为选择性清除受损线粒体的质量控制机制，对细胞存活至关重要，药理学或遗传学增强线粒体自噬可减轻肝损伤，因此鉴定内源性或外源性线粒体自噬诱导因子具有重要价值。肝脏经门静脉循环与肠道直接相连，是肠道来源微生物信号的首要靶器官。尽管短链脂肪酸、次级胆汁酸等微生物代谢物对线粒体能量代谢与氧化应激的调控已有较多认识，但直接调控肝细胞线粒体自噬的微生物成分尚未明确。既往研究显示，大肠杆菌来源的PGN片段可减少线粒体应激、增强ATP合成；研究人员前期工作发现热灭活大肠杆菌（heat-killed E. coli, HK E. coli）可缓解对乙酰氨基酚（acetaminophen, APAP）诱导的肝损伤（APAP-induced liver injury, AILI），但其活性成分与作用机制尚待阐明。基于此，研究人员提出科学问题：HK E. coli能否通过细菌细胞壁成分直接激活肝细胞线粒体自噬从而减轻肝损伤与肝纤维化。

**研究内容与意义**

研究人员通过体内外研究鉴定出PGN为该保护性信号。PGN被肝细胞主动摄取并与线粒体结合，经其N端结构域特异性识别自噬衔接蛋白p62（SQSTM1），促进p62-LC3向线粒体募集，启动线粒体自噬。肝细胞中PGN诱导的线粒体自噬可抵御APAP诱导的肝细胞坏死；在CCl₄诱导的肝纤维化模型中，口服PGN减少肝细胞损伤、胶原沉积与HSC激活，且损伤建立后给药仍具治疗作用；肝特异性p62耗竭显著削弱其抗纤维化效应；上述作用独立于经典NOD1/2信号。该研究将细菌细胞壁成分的功能拓展至先天免疫识别之外，建立了微生物信号-肝细胞线粒体质量控制-肝稳态的直接联系，揭示了此前未被认识的"肠道微生物-线粒体自噬轴"，为微生物组启发的肝病治疗策略提供了理论基础。

**关键方法**

研究人员采用的关键技术包括：从大肠杆菌OP50提取PGN并经口服灌胃给药；蛋白质组学（LC–MS/MS，液相色谱-串联质谱）鉴定PGN结合蛋白；基于mt-Keima报告系统的流式细胞术与共聚焦活细胞成像定量线粒体自噬；透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察线粒体自噬体；RNA-seq转录组分析；CRISPR-Cas9联合AAV8（腺相关病毒，thyroxine-binding globulin, TBG启动子）实现肝特异性p62敲除。样本队列为C57BL/6J野生型小鼠、Rosa26-Cas9敲入小鼠及Nod2敲除小鼠（每组3–12只），细胞系包括AML12、Huh7与HEK293T。

**研究结果**

（1）PGN减轻肝细胞死亡（PGN attenuates hepatocyte death）：口服HK E. coli显著缩小APAP所致小鼠肝坏死面积并降低血清丙氨酸氨基转移酶（alanine transaminase, ALT）；SYTOX Green染色显示纯化PGN可单独模拟该保护效应。检测显示HK E. coli不改变CYP2E1蛋白水平、NAPQI加合物形成与谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平，提示其保护并非通过干预对乙酰氨基酚代谢，而是直接增强肝细胞存活。

（2）PGN靶向线粒体并与线粒体蛋白结合（PGN targets mitochondria and associates with mitochondrial proteins）：FITC标记的PGN（FITC，异硫氰酸荧光素）在体外与体内均被肝细胞高效摄取，抑制肌动蛋白聚合（细胞松弛素D）、dynamin（dynasore）或网格蛋白介导的内吞（氯丙嗪，CPZ）均可降低摄取，表明其为主动过程；658个PGN结合蛋白中近50%注释为线粒体蛋白；免疫荧光显示FITC-PGN与线粒体外膜蛋白TOMM20共定位；MitoTracker Deep Red与TMRM（四甲基罗丹明甲酯）检测显示PGN在基础状态及APAP应激下维持线粒体膜电位与完整性。

（3）PGN在肝细胞中触发线粒体自噬（PGN triggers mitophagy in hepatocytes）：mt-Keima流式与成像显示PGN提高酸性/总线粒体比例，与CCCP（羰基氰化物间氯苯腙）阳性对照相当；LC3-II增加，且经巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1, BAF）处理后LC3-II与p62进一步累积，证实完全自噬流；TEM显示线粒体自噬体显著增多；线粒体与溶酶体标记Lamp1（溶酶体相关膜蛋白1）共定位增强；RNA-seq提示吞噬体相关通路富集。

（4）PGN直接与p62相互作用促进线粒体自噬（PGN directly interacts with p62 to promote mitophagy）：内源及重组蛋白pull-down显示PGN特异性结合p62，肝素（多聚阴离子）竞争不破坏该相互作用；p62截短突变分析确定N端PB1/ZZ+H区域为PGN识别所必需；免疫共沉淀显示PGN增强p62-LC3结合，且该结合依赖p62的PGN结合区；高分辨率成像显示PGN促进p62募集至线粒体并增强线粒体位点p62-LC3共定位。

（5）PGN诱导的线粒体自噬在体内依赖p62（PGN-induced mitophagy requires p62 in vivo）：AAV8-TBG-mtKeima活体成像显示口服PGN显著增加肝脏酸性mt-Keima信号；在Rosa26-Cas9小鼠中经AAV-Tbg-sgp62实现约70%肝p62敲低后，PGN诱导的肝脏线粒体自噬几乎完全被消除。

（6）PGN以p62依赖性方式缓解肝纤维化（PGN alleviates hepatic fibrosis in a p62-dependent manner）：线粒体分裂抑制剂Mdivi-1可阻断PGN诱导的线粒体自噬并消除其抗坏死作用；CCl₄模型（每周两次、共5.5周，第3周起口服PGN）中，末次给药24小时后肝N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid, NAM）由约165 ng/g升至约1400 ng/g；PGN使血清ALT降低约50%，天狼星红阳性胶原沉积减少约35%，desmin（结蛋白）阳性HSC激活减少约40%；损伤建立后治疗性给药仍降低ALT与胶原沉积；AAV介导的肝特异性p62耗竭（约50%）显著削弱PGN的抗胶原沉积与抗HSC激活效应。

（7）PGN介导的抗CCl₄肝纤维化保护作用独立于NOD1/2信号（PGN-mediated protection against CCl₄-induced hepatic fibrosis is independent of NOD1/2 signaling）：Nod2敲除联合AAV-U6-shNod1抑制Nod1后，PGN的抗纤维化作用及其对p62/LC3通路的调控均完整保留。

**讨论与结论**

讨论指出，该研究将细菌细胞壁成分的功能拓展至经典先天免疫识别之外，揭示微生物产物可独立于模式识别受体信号直接调控细胞器质量控制。研究同时承认若干局限：Mdivi-1对线粒体呼吸与ROS存在线粒体自噬之外的效应，p62亦参与泛素依赖的cargo处理与应激信号，故p62耗竭所致保护效应削弱不能完全归因于线粒体自噬受损；内吞后PGN如何到达线粒体（如经SLC15家族转运体、内体膜透化或与ATP5A1相互作用）尚缺乏直接证据；NAM升高仅证明PGN来源物质到达肝脏，不能证实完整PGN存在；内源性PGN的生理丰度、分子种类与组织分布尚未测定，肝病中保护性PGN来源细菌丰度变化与损伤所致线粒体自噬需求增加两种可能尚无法区分。既往研究显示PGN来源的muropeptide可经ATP合酶激活增强线粒体功能，胞壁酰二肽（muramyl dipeptide, MDP）可诱导Nod2-ATG16L1依赖的线粒体自噬，提示不同PGN来源物种可通过互补途径调控线粒体质量；PGN的作用在进化上兼具精细性——在促进线粒体质量控制的同时不诱发过度自噬。

研究结论为：细菌肽聚糖（PGN）是促进肝细胞线粒体质量控制的微生物信号，其作用通过p62（SQSTM1）依赖性线粒体自噬途径实现；该发现将细菌细胞壁成分与独立于经典NOD1/2信号的肝脏线粒体稳态相联系，揭示了宿主-微生物通讯的新维度，并提示微生物组启发的策略在限制肝损伤与纤维化方面具有潜在应用价值。