《EMBO REPORTS》：Fat cadherin cleavage releases a nuclear fragment to regulate gene transcription
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非典型Fat（Ft）钙黏蛋白在从果蝇到哺乳动物的多种生物中调控生长、平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）和代谢。Ft蛋白的胞内域FtICD在顶端连接质膜上调控Hippo和PCP通路的组分。研究人员意外发现，FtICD的一个片段被输入
非典型Fat（Ft）钙黏蛋白在从果蝇到哺乳动物的多种生物中调控生长、平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）和代谢。Ft蛋白的胞内域FtICD在顶端连接质膜上调控Hippo和PCP通路的组分。研究人员意外发现，FtICD的一个片段被输入细胞核，并鉴定出两个保守的核定位信号（nuclear localization signal，NLS）。膜结合的FtICD在体内被切割并进入细胞核；针对内源Ft的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）实验鉴定出推定的Ft靶基因，包括参与信号通路、染色质组织和模式形成的基因。FtICD的异位表达抑制翅膀生长、改变PCP并改变许多基因的表达。FtICD与Hippo转录效应因子Scalloped（Sd）和Yorkie（Yki）形成复合物，且Ft的ChIP-seq峰与Scalloped和Yorkie的峰共定位。研究人员提出，对Hippo通路活性和PCP的调节构成Ft的核内功能，补充其作为Hippo信号上游调节因子的既定功能。
论文解读
多细胞生物必须精确控制组织生长与稳态，Hippo信号通路在其中发挥核心作用。该通路的核心激酶Hippo（Hpo）和Warts（Wts）抑制转录共激活因子Yorkie（Yki）的核定位与活性；Yki与转录因子Scalloped（Sd）共同调控增殖和凋亡相关靶基因。非典型钙黏蛋白Fat（Ft）已被确立为Hippo通路的上游调节因子，并参与平面细胞极性（planar cell polarity，PCP）调控。Ft是巨型跨膜蛋白，定位于顶端连接，通过Expanded、Dachs及Dachsous等分子执行功能，其胞内域还可产生线粒体靶向片段。然而，过去研究主要关注Ft在细胞表面的作用，对其是否在细胞核内直接调控转录缺乏认识。鉴于Ft能与转录共抑制因子Atrophin（Atro）相互作用，研究人员提出Ft可能具有核内功能，并对此开展系统验证。
研究人员发现Ft的胞内域FtICD含有两个保守的核定位信号（nuclear localization signal，NLS）和一个核输出信号（nuclear export signal，NES），膜结合的Ft可被切割并释放FtICD片段进入细胞核。内源Ft的ChIP-seq显示Ft能结合众多基因调控区；过表达FtICD可抑制翅膀生长、改变眼睛和翅膀的PCP，并显著改变大量基因表达。FtICD能与Yki和Sd形成复合物，其基因组结合位点与Yki/Sd显著共定位。该研究首次提出Ft通过核内片段调节Hippo通路活性和PCP，补充其作为Hippo信号上游调节因子的经典功能，具有重要的发育生物学意义。
研究使用了果蝇S2细胞、三龄幼虫眼-脑复合体、成虫盘及16–20 h胚胎等样本。主要技术方法包括：截短体定位与免疫荧光分析鉴定NLS/NES；FtΔECD-Gal4VP16/UAS-mCherry报告系统检测体内切割；多线染色体免疫染色观察内源Ft与染色质结合；针对过表达FtICD-3xFLAG及内源GFP标记Ft（Ft-GFPC和Ft-GFPint）的ChIP-seq；RNA-seq；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）和酵母双杂交（yeast two-hybrid，Y2H）；翅膀与眼睛表型定量；以及整合公开ChIP-seq数据的聚类和基序分析。
**结果**
**FtICD定位于细胞核并具有两个高度保守的核定位信号**：S2细胞中FtICD-HA富集于核内，截短体分析鉴定两个与人类Fat4保守区重叠的NLS和一个NES；在眼成虫盘中，FtICD在未分化细胞核内积累并与DNA共定位，且排除于核仁。
**FtICD以空间限制方式从细胞膜释放并结合染色质**：FtΔECD-Gal4VP16切割报告显示体内存在Ft切割，在脑的髓质成神经细胞和薄层神经元等区域活性最强；多线染色体上内源Ft呈带样分布并与RNA聚合酶Ⅱ部分重叠，而ft突变体中该信号消失。
**FtICD表达以不依赖上游Hippo通路的方式影响生长和PCP**：过表达FtICD使翅面积减小、翅变圆、交叉脉间距缩短，眼出现背腹极性反转和不规则赤道线；Dachs蛋白水平未下降，说明其作用不通过去除顶端Dachs实现。
**FtICD可激活Hippo通路靶基因的表达**：在hpo突变克隆中，FtICD可部分激活含突变Sd结合位点的Hippo响应元件HREm6，但单独FtICD不能激活，且眼盘中不能激活，显示组织依赖性；Expanded表达不受影响。
**过表达FtICD的ChIP-seq揭示其特异性结合基因调控区**：幼虫眼-脑复合体FtICD-3xFLAG的ChIP-seq峰主要分布于启动子和增强子区，富集平面极性和Hippo信号等通路，结合位点包括dachs、kibra、Map205、rasputin和Tgi等。
**FtICD-FLAG ChIP-seq峰与Yki和Sd峰全基因组相关**：FtICD峰与Sd、Yki峰的相关系数分别为0.56和0.53；聚类分为FtICD单独占据、与Yki/Sd共占据和Yki为主三类；ATAC-seq比较显示FtICD结合不能仅用开放染色质解释。
**FtICD峰与一部分Atro峰相关**：整合Atro和GAF数据发现一类FtICD/Atro/GAF共结合位点，另一类主要与Yki共结合，提示FtICD参与至少两种染色质调控模块。
**FtICD与Yki和Sd形成复合物**：Co-IP显示FtICD-FLAG能与Yki-HA共沉淀，并与Sd的C端片段结合；Y2H实验进一步支持FtICD与Sd之间存在直接相互作用。
**FtICD结合与Hippo通路及其他靶基因的转录调控相关**：FtICD结合ft、yki、Cka、Tgi、Leash等调控区；RNA-seq显示yki、Cka、Tgi和Leash显著上调，expanded无显著变化；非Hippo基因中Acf和pon下调，CG32581、UQCR-C2、rin和Khc上调，说明FtICD既可激活也可抑制转录。
**内源Ft ChIP-seq证明内源Ft可进入细胞核并结合靶基因**：两种独立的内源GFP标记Ft品系（Ft-GFPC和Ft-GFPint）的胚胎ChIP-seq信号高度一致，高置信峰分别为1471和1358个；GO分析富集Hippo信号、平面极性和染色质组织，靶基因包括Map205、bazooka、hat-trick和Ataxin7。
**一部分内源Ft结合基因在ft突变体胚胎中表达失调**：ft突变体胚胎RNA-seq鉴定934个差异表达基因，与Ft结合位点交集仅19个；胚胎中Hippo靶基因无显著变化，与幼虫期调控形成对比；hat-trick下调和Map205上调。
**不同的转录调控因子组合定义内源Ft结合位点**：将内源Ft ChIP-seq与Yki、Sd、Atro、Nerfin-1、Trl公共数据聚类得到8类结合模式；许多位点与Sd/Yki共占，另有位点分别与Sd、Atro、Nerfin-1或Trl组合。
**基序分析鉴定额外的潜在DNA结合伙伴**：内源Ft峰的de novo基序富集DREF、ZIPIC、M1BP、GATAe和Homothorax（Hth）的结合位点，其中Hth已知可与Yki合作，提示这些因子可能参与Ft的募集。
讨论部分指出，过去认为Ft仅在细胞表面发挥作用，本研究的证据支持其核内功能。FtΔECD可在体内被切割并释放核内片段，切割在脑特定区域增强，但蛋白酶尚未鉴定。内源核Ft水平极低，类似Notch的情形。FtICD结合Sd的C端区域，该区域也是Yki结合域，提示可能存在竞争或复合物动态。FtICD结合expanded、kibra等上游Hippo组分，可能构成反馈调节。两个NLS的保守性提示人类中可能存在类似核内功能。NES与线粒体定位及Hippo活性区域重叠，可能涉及胞内定位选择。FtICD过表达不降低Dachs，支持其在Dachs下游或平行发挥作用。研究结论可译为：研究人员提出，对Hippo通路活性和PCP的调节构成Ft的核内功能，补充其作为Hippo信号上游调节因子的既定功能。
