《Biosensors and Bioelectronics》：A FEN1-EDCR Dual-Amplification Strategy for Ultrasensitive Detection of CHCHD10 c.176C>T Mutation
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高效检测复杂样本中CHCHD10基因突变的新方法：融合FEN1酶解与EDCR扩增及磁分离纯化技术，实现0.23 pM检测限和0.01%突变丰度区分，适用于人血清和高背景基因组DNA检测。
韩潘|赵慕丽格|何淼|陈金华|尹飞凡|蔡永亮|程文婷|王中云|向阳
中国南京大学生命科学学院药物生物技术国家重点实验室，南京210023
摘要
CHCHD10基因中的单碱基突变会损害产热反应，并抑制白色脂肪组织向米色脂肪组织的有效转化。然而，在复杂的生物基质中高保真地检测这种低丰度的单核苷酸多态性（SNPs）仍然是一个关键的技术挑战。本研究开发了一种新的方法，通过整合 flap 内切酶 1（FEN1）的特异性识别和熵驱动电路反应（EDCR）的级联放大来检测CHCHD10中的单碱基突变，并通过磁分离来抑制背景干扰。在此过程中，突变靶标（MT）与上游探针（UP）和发夹形下游探针（DP）杂交形成特定的三碱基重叠结构。FEN1 识别并切割该结构，释放出切割序列（CS）。经过磁分离后，CS 激活 EDCR，实现双信号放大。发夹形 DP 的设计有效隐藏了 CS，显著降低了背景噪声。该方法的可检测限为 0.23 pM，能够在混合 DNA 样本中区分低至 0.01% 的突变丰度，并在人类血清和高背景基因组 DNA 等复杂基质中表现出稳健的性能。这项工作为检测复杂样本中的低丰度点突变提供了一种创新且可靠的方法工具。
引言
CHCHD10（包含 10 个卷曲-螺旋-卷曲-螺旋结构域的基因）编码的线粒体蛋白是维持线粒体嵴结构稳定性和能量代谢平衡的核心因素。该基因中的单碱基突变会损害产热反应，并抑制白色脂肪组织向米色脂肪组织的有效转化。CHCHD10 在线粒体能量代谢和脂肪组织调节中起着不可或缺的作用（Campos-Ribeiro 等，2025；Ding 等，2022；Pfanner 等，2014；Wu 等，2025）。这种功能获得性突变的致病性已被充分证实，因为它会导致线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）复合体的解体以及线粒体嵴连接点的丧失（Genin 等，2016）。这些超结构和功能紊乱会导致一系列严重的细胞后果，包括呼吸链缺陷、线粒体网络碎片化（Bannwarth 等，2014；Liu 等，2023），并与模型系统中的全身代谢失调有关（Genin 等，2019）。鉴于这种突变是线粒体疾病的重要遗传因素，其精确检测在生物学上具有重要意义，同时在技术上也具有挑战性。这使其成为严格评估新的检测技术和验证新型生物传感策略性能的理想模型。
然而，在复杂的生物基质中高保真地检测这种低丰度突变仍然是一个关键的技术挑战。目前，用于检测基因突变的成熟方法包括下一代测序（NGS）（Guibert 等，2018；Sun 等，2018）、实时定量 PCR（qPCR 或 RT-qPCR）（Chen 等，2022；Edison 等，2009）和全基因组测序（WGS）（Hoermann 等，2021；Kobren 等，2025）。这些传统技术通常受到高设备成本、复杂实验程序、次优敏感性和特异性的限制。此外，许多此类方法依赖于纯化的核酸，对于低丰度靶标来说这一过程可能效率低下（Mir 和 Southern，1999；Samad Hosseini 等，2022）。
为了解决这一挑战，我们开发了一种新的集成检测策略，选择线粒体蛋白 CHCHD10 中的致病性 c.176C>T (p.Ser59Leu) 突变作为严格的验证模型。我们策略的核心创新性地结合了两种有利机制：flap 内切酶 1（FEN1）的特异性识别和熵驱动电路反应（EDCR）的高效放大。FEN1 是一种结构特异性核酸酶，可催化链入侵反应，在特异性单碱基识别中起关键作用（Li 等，2022；Wang 等，2022）。FEN1 能够高效识别三碱基重叠结构并切割下游探针的 5' 端，从而启动入侵过程并实现信号放大（Cheng 等，2021；Wu 等，2022）。EDCR 是 DNA 逻辑电路领域的一项重大进展（Li 等，2021；Simmel 等，2019；Zhang 等，2007）。利用快速放大动力学、灵活的序列设计、优异的热稳定性和在复杂环境中的稳健性能，基于 EDCR 的策略已成功应用于核酸检测，提高了灵敏度（Lin 等，2025；Luo 等，2024；Lv 等，2015）。与其他无酶放大方法相比，EDCR 具有更高的信噪比和更高的灵敏度，使其成为信号放大的非常有前景的方法。
基于这一原理，我们构建了一种结合磁分离的 FEN1-EDCR 双放大策略。该平台操作包括三个精确耦合的步骤。首先，靶标激活 FEN1 的切割反应，循环释放线性切割序列（CS）。随后，生物素-链霉亲和素磁珠分离有效去除残留的杂交复合物，从而显著降低非特异性背景。最后，纯化的 CS 触发 EDCR，通过催化链置换实现高效信号放大。为了验证这种 FEN1-EDCR 策略，我们使用了致病性的 CHCHD10 c.176C>T (p.Ser59Leu) 点突变模型。结果表明，其检测限为 0.23 pM，并能在混合 DNA 样本中稳定区分低至 0.01% 的突变丰度。在使用人类血清和高背景基因组 DNA 等复杂基质的尖峰恢复实验中，该方法表现出优异的稳健性和准确性。
本研究不仅报告了一种创新且可靠的级联检测架构，而且通过从合成系统到模拟复杂基质的全面验证，为开发用于复杂生物样本中低丰度点突变的分析工具提供了坚实的方法学见解和实验证据。
试剂和材料
FEN1 和 NEBNext dsDNA Fragmentase 从 New England Biolabs, Inc.（中国北京）购买。FEN1 反应在供应商推荐的最佳温度下进行。BeaverBeads? Streptavidin 磁珠（SMBs，大小为 300 nm）从 Beaver Co. Ltd.（中国苏州）购买。本方案中使用的 DNA 序列来自 Sangon Biotechnology (Shanghai, China) Co., Ltd.。所有序列均显示在补充文件中的表 S1 中。
传感原理
基于 FEN1 介导的入侵反应和 EDCR 放大的 CHCHD10 突变检测机制的示意图如图 1 所示。合理设计了上游探针（UP）和带有粘性末端的发夹形下游探针（DP）。突变靶标（MT）与 UP 和 DP 杂交形成三碱基重叠结构，该结构被 FEN1 特异性识别。
结论
总之，本研究开发了一种基于 FEN1 介导的入侵反应与 EDCR 双信号放大相结合的新方法，用于高灵敏度检测 CHCHD10 c.176C>T 点突变。这种方法具有几个显著优势：首先，专门设计的 UP 和发夹形 DP 与 MT 杂交形成三碱基重叠结构。FEN1 精确识别并切割该结构，实现高特异性的靶标识别和初始信号放大。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
CRediT 作者贡献声明
王中云：资源获取、资金筹措。
向阳：写作 – 审稿与编辑、监督、资金筹措、概念构思。
蔡永亮：方法学。
程文婷：方法学。
陈金华：验证。
尹飞凡：研究。
何淼：验证、研究。
韩潘：写作 – 原始草稿、验证、方法学、研究、正式分析。
赵慕丽格：验证
数据可用性
数据将应要求提供。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（批准号：82371283、82571445、81672570）、天然与仿生药物国家重点实验室（批准号：K202009）以及江苏省自然科学基金（BK20240264）的支持。
