环化和消除策略被广泛用于高效的药物递送。三甲基锁 (TML) 是一种邻羟基二氢肉桂酸衍生物，其中三个悬挂的甲基之间的不利空间相互作用促进了快速的内酯化反应，形成了氢香豆素结构[1], [2]。这种速率提升归因于 Thorpe–Ingold 效应，该效应由 gem-二甲基基团诱导，并结合了芳香甲基的空间排斥[3]。值得注意的是，所有三个甲基的存在对于这一过程是必需的[4]。由于其多功能性，TML 系统已被广泛用于药物开发、前药设计[5], [6], [7] 和分子成像[8]。它独特的能够实现药物[9], [10], [11]、染料[12], [13] 或成像剂[14], [15], [16], [17] 的时空可控释放的能力，使其成为提高治疗和诊断化合物精确度和疗效的非常有价值的工具。
抗体-药物偶联物 (ADCs)，以 Enhertu? (DS-8201a) 的临床成功为例，已在癌症治疗中取得了变革性的进展，提供了新的治疗模式并重塑了肿瘤学的治疗策略[17], [19], [20], [21]。然而，在 ADC 开发中仍存在几个挑战，包括脱靶毒性、有限的药物-抗体比 (DAR) 和狭窄的位点特异性偶联策略范围。这些限制是提高基于 ADC 的治疗的疗效、安全性和适应性的主要障碍[22], [23]。为了改善 体内 药物递送并最大化治疗效果，一种直接且被广泛采用的策略是提高载荷-连接子复合物的水溶性或使用更稳定的化学连接子[23], [24]。有趣的是，TML 系统尚未被用于设计酶可切割连接子或开发高药物-抗体比 (DAR) 的 ADCs。
用于 ADCs 的酶可切割连接子的开发可以追溯到 20 世纪 90 年代末[25]。这些连接子由于对哺乳动物细胞中的溶酶体酶具有敏感性而具有很大的潜力，这些酶具有双重催化活性：内肽酶（切割内部肽键）和羧肽酶（切割末端残基）[26], [27]。为了提高连接子的性能，通常会加入对氨基苄基 carbamate (PABC) 间隔基团，通过优化的空间分离来减少载荷和切割位点之间的空间阻碍[28], [29]。其中，缬氨酸–瓜氨酸–PABC (VC–PABC) 基序已成为 ADC 设计中的基础元素，并被用于几种已批准的 ADCs，包括 Polivy?, Padcev? 和 Tivdak?，以及许多临床试验中的候选药物[22], [23], [24]。然而，尽管 VC–PABC 连接子应用广泛，但它存在几个局限性：(1) 功能基团的刚性：PABC 间隔基团限制了载荷偶联化学的多样性；(2) 与酯键相关的问题：由于小鼠血浆中存在 Carboxylesterase 1c 以及在中性 pH 条件和血浆下水解的碳酸酯键的半衰期较短，可能会增加过早切割的风险，从而导致脱靶毒性[26], [29], [30], [31]。这些问题突显了迫切需要新型间隔基团或适配器片段，以实现更高效的药物释放，同时提高连接子设计的稳定性和模块化。
先前的研究表明，酚羟基的 pKa 值必须低于 9.2，才能促进对氨基苄基醚 (PABE) 间隔基团的快速自切割反应[31], [32]。通过预测 pKa 值和结构潜力，向 TML 架构中引入两个氯原子可以降低所得片段的 pKa 值。研究表明，降低 pKa 值可以加速环化动力学[31]。因此，在这项研究中，将 TML-2Cl 基团引入 ADC 架构中，通过 cathepsin B 可切割连接子（如 Gly-Gly-Phe-Gly 或 Val-Ala）实现 Exatecan（一种强效拓扑异构酶 I 抑制剂）的有效释放。这种策略利用了肿瘤微环境中 cathepsin B 的高表达来实现肿瘤特异性载荷释放。此外，使用酰胺键代替酯键可以提高稳定性，降低脱靶毒性，并提高治疗效果，为含有 NH2 的药物提供了一种基于酰胺的偶联策略。
基于 HER2 靶向的单克隆抗体 trastuzumab，本研究引入了一种有意义的 cathepsin B 可切割连接子设计策略，该策略在 ADCs 中包含了 TML-2Cl 基序。系统地评估了不同溶解度特征和 cathepsin B 介导的切割机制对 ADC 性能的影响体外。此外，还 体内 评估了两种具有不同亲水模块（PSAR-10 和 PEG-8）的 ADCs，以 Her2-Deruxtecan 作为阳性对照。初步评估了含有 TML-2Cl 的高 DAR ADCs 的可行性。
