《Plant Molecular Biology》：Applications of omics in deciphering the unique traits of durian, the king of fruits
组学技术揭示榴莲生物学特性
榴莲（Durio zibethinus），被誉为“果中之王”，是一种广泛种植于东南亚地区的高经济价值热带水果。随着组学技术的快速发展，利用多种组学方法对榴莲进行的研究已广泛开展。目前，组学研究主要集中于商业品种（如D. zibethinus），对地方性、商业化程度较低的地方榴莲物种（Durio sp.）关注相对较少。本文综述了在商业品种和不同物种的地方榴莲上进行的组学研究，探讨了其在进化研究、理解果实成熟机制、鉴定育种遗传标记、挖掘其药物和工业潜力以及采后加工等方面的应用，并讨论了当前榴莲组学研究的局限性和未来研究前景。
榴莲中进行的组学类型
组学技术包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，分别用于研究生物体内的基因、mRNA、蛋白质和代谢物。这些方法有助于鉴定与品质和抗病性相关的性状。迄今为止，组学研究主要聚焦于不同商业榴莲品种，对地方榴莲物种的关注相对较少。商业榴莲品种包括来自马来西亚的猫山王（Musang King, MK），以及来自泰国的普曼尼（Phuangmanee, PM）、查尼（Chanee, CH）、金枕头（Monthong, MT）、干尧（Kanyao, KY）和春武里1号（Chanthaburi 1，CH和MT的杂交种）。
基因组学
基因组包含核基因组和细胞器基因组，是生物体的遗传蓝图。通过基因组测序和分析解读该蓝图，为了解遗传结构、鉴定与特定性状相关的基因、检测物种内和物种间的遗传变异以及辅助进化研究提供了宝贵见解。大规模测序技术主要有短读长和长读长测序两种类型。短读长测序平台（如Illumina和MGI Tech）产生的读长平均为100–150 bp。而长读长测序平台（如PacBio和Oxford Nanopore）产生的读长显著更长，通常超过15 kb。然而，对于真核生物基因组，长读长测序只能将基因组组装到支架（scaffold）水平。要达到染色体水平的组装，需要额外的方法，如来自Dovetail Genomics的染色体构象捕获（Hi-C）技术和来自Bionano的光学图谱技术。
首个榴莲栽培品种猫山王（Musang King）的基因组草图由Teh等人于2017年报道。该基因组使用PacBio RSII平台测序，并利用Dovetail Genomics进行支架构建，最终产生了30条染色体规模的假分子，总长度为738 Mbp。该工作发现了重要的榴莲特异性古多倍化事件，该事件已扩展为四个拷贝。此外，对该基因组的重新分析发现榴莲谱系中存在的是六倍化而非四倍化。由于这些基因产生挥发性硫化合物（VSCs），这种基因组结构解释了榴莲特有香气的产生，这种香气被一些消费者认为是恶臭，但却是榴莲爱好者独特的香气。2019年，猫山王基因组被整合进MaGenDB数据库，与另外12个锦葵科物种的基因组数据并列。
尽管猫山王基因组是草图版本，但它为后续对其他品种的重测序和比较基因组研究提供了参考基因组。对三个泰国榴莲品种（Kradumthong, Monthong, Puangmanee）的泛基因组分析共发现了49,631个基因，其中39个基因在这些品种间存在存在/缺失（PAV基因）。同时，发现猫山王基因组含有更多的这些PAV基因的拷贝数变异，表明潜在的基因结构决定了每个品种的独特性。2024年，对源自泰国的干尧（Kan Yao）品种进行了测序和从头组装，通过结合使用PacBio、Oxford Nanopore、Illumina和Dovetail Genomics四种测序技术，获得了由28条假染色体组成的777.8 Mb单倍体基因组。有趣的是，重复基因的大部分富集在苯丙烷途径的木质素生物合成模块中，这可能导致了榴莲果实坚硬刺的形成。与此同时，Ji等人解析了同一干尧品种的高质量染色体水平单倍体基因组。两个单倍体基因组被组装和表征为两种单倍型，从中可以确定结构变异。此外，28条染色体中有19条被无间隙地组装。这些发现因此将当前的遗传变异分析转向了基因组结构分析。它不仅为基因组分析树立了基准，也可作为从中衍生遗传标记的参考，用于榴莲的分子育种。
转录组学
基因组分析可鉴定基因及其在基因组中的变异，但基因功能只有在基因被异源表达并在明确定义的时空条件下进行分析时才能推断。因此，转录组学分析旨在从基因组总基因中识别和量化差异表达的基因集。因此，转录组学是对细胞或细胞群体中存在的所有RNA（包括异构体）的研究。由于长读长测序可以捕获全长转录本，它能够明确识别由可变剪接事件产生的不同异构体。在果实研究中，转录组学研究主要关注不同果实品种、果实器官、发育阶段、抗病品系和果实成熟过程中的基因表达。
虽然干尧品种使用了PacBio和长读长测序平台进行测序，但其他榴莲转录组研究主要使用短读长测序平台，如Illumina或MGI Tech。值得注意的是，榴莲的转录组学研究数量多于基因组学研究。大多数榴莲转录组学研究主要侧重于基因表达研究，通常使用三个重复样本，但涉及六个马来西亚榴莲品种的研究除外。然而，用于识别差异表达基因的阈值在不同研究间有所不同。
首个榴莲转录组数据源自猫山王（果肉、根、茎、叶）、金枕头（果肉）和普曼尼（果肉）品种。已进行了比较转录组分析，包括：（1）果实果肉与根、茎、叶等其他植物器官的比较；（2）榴莲果肉与其他物种果肉的比较；（3）不同榴莲品种（包括猫山王、金枕头和普曼尼果实）之间的比较。这些研究揭示，与非果肉器官相比，硫相关、成熟相关和风味相关过程在榴莲果肉中显著上调。还对泰国金枕头品种的五个成熟阶段进行了比较分析。在D24品种中，转录组分析显示细胞壁软化基因，如果胶酶和果胶修饰酶，在果实成熟期间上调。此外，对六个马来西亚榴莲品种（D24, D99, D160, D168, D197, D200）在两个发育阶段（成熟和完熟）的转录组分析证实，脂肪酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、类胡萝卜素生物合成、苯丙烷生物合成和半乳糖代谢是通过KEGG分析鉴定的最常见通路。挥发性硫化合物（VSCs），如通过甲硫氨酸γ-裂解酶（MGL）基因家族产生的乙硫醇，受转录因子同源结构域亮氨酸拉链（HD-ZIP）调控。这些通路被推测促进了榴莲果实成熟过程中独特的奶油质地和芳香氣味的形成。除了差异表达研究，D24品种的转录组分析还能够识别出参与果实发育和成熟的先前未知的转录本和新外显子。
对干尧品种的茎、叶、花以及不同开花后天数的不同果实组织样本进行的转录组分析共同识别出约92,000个转录本，这些转录本源自约50,400个编码基因。后续注释发现了约5400个非编码基因，包括280个microRNA。然而，尽管这项工作的发现对于未来分析调控果实发育和成熟的表达基因很有价值，但并未进行进一步的下游分析。作为补充，来自五个品种（即KD, MT, PM, MK, Salika (SK)）叶片的泛转录组分析有助于识别所有品种中均表达的基因集（称为核心直系同源基因）。而仅在一个品种中发现的独特基因集是附属基因的富集，这些基因决定了每个品种的具体特征。这些包括参与花形成的植物转化酶/果胶甲基酯酶抑制剂，参与果实成熟的氨基环丙烷-1-羧酸（ACS），以及与刺形成相关的木质素生物合成途径中的基因。然而，这些基因应对榴莲果实生长和发育的共同通路负责，而非特定于某个品种，因此需要进一步研究来解决这个问题。
同样有趣的是，一些品种表达了不同的病原响应基因组，这些基因通过计算机推断可赋予对Peronospora parasitica、P. syringae等的抗性，此外还有在热胁迫下上调的热激蛋白。为了验证病原响应基因的表达，对活体植物感染了Phytophthora palmivora（一种导致东南亚作物严重损失的破坏性卵菌）后进行了转录组分析。发现与易感品种（金枕头和Kradumthong）相比，抗性品种普曼尼显著表达编码几丁质响应蛋白（如lysM结构域受体样激酶和内切几丁质酶）的基因。几丁质由Phytophthora的游动孢子释放，然后诱导植物先天免疫。所有受感染的品种都表达了大量的热激蛋白，如HSP70和ERdj3B，推测这些蛋白可维持抗病蛋白的正确折叠和功能。由胁迫响应转录因子（例如WRKY40和ERF1A）介导的转录重编程被病原体感染触发。总之，转录组分析的发现应可作为分子参考，用于根据不同种植环境、不同国家农业实践中天然存在的病原体来选择品种。
总体而言，转录组学研究为理解榴莲果实发育、成熟和香气产生的分子基础做出了重要贡献。然而，它不能直接反映合成了哪些蛋白质或它们在生物体内如何发挥作用。因此，蛋白质组学研究同样重要，它通过揭示实际合成的蛋白质、它们的丰度及其在果实发育和成熟过程中的功能作用，来补充转录组学数据。
蛋白质组学
蛋白质组学涉及细胞、组织或生物体中蛋白质的大规模识别和定量。高通量蛋白质组技术范围从基于质谱（MS）的方法到单分子（SMP）和单细胞蛋白质组学（SCP）。蛋白质组学研究中的一个关键步骤是优化蛋白质提取，以识别样品中存在的蛋白质的最佳数量。对于猫山王品种，丙酮-酚提取法已被确定为最有效的方法。迄今为止，尽管榴莲蛋白质组学研究在增强我们对果实发育、成熟和香气产生分子机制的理解方面具有巨大潜力，但相关研究仍然很少。
差异调控基因的转录组测定仅限于识别表达的基因，每个基因及其异构体的功能是通过计算机预测的。蛋白质组分析通过检测和定量最终阶段的所有表达蛋白质来解决这一缺点，判断某些蛋白质在翻译后可能经历了蛋白质修饰。因此，建议构建代表果实发育、果实成熟和采后衰老不同显著阶段的蛋白质组图谱。随后的比较分析将有助于揭示差异表达蛋白及其在果实发育或成熟分子生物学中的相关作用。
可以预见，蛋白质组分析的重点应放在蛋白质-蛋白质相互作用上，特别是由转录因子（TFs）作为主要上游基因调控因子介导的相互作用。最近一项关于MYB转录因子在榴莲果实发育中作用的研究发现，DzMYB2在调控果肉中类黄酮产生的苯丙烷途径中作为激活剂发挥作用，而DzMYB3则作为抑制子。可以预测，一个植物基因组可能含有数千个TF基因。由于TFs通过与靶蛋白形成分子关联形成复合物来发挥其调控作用，分离TF将同时回收所有靶蛋白。由于多个TF家族及其成员有不同的靶蛋白，纯化所有TFs将从蛋白质组中提取所有靶蛋白。随后，复合物内和跨复合物的蛋白质之间的相互作用可以被表征为蛋白质-蛋白质相互作用网络。这将生成一个具有功能相互作用细节的蛋白质组，从而通向所研究的机制。
代谢组学
代谢物是基因表达及其功能蛋白质翻译后修饰的最终产物。代谢组学是对代谢途径的中间或最终产物代谢物的研究。它可以分为靶向方法和非靶向方法，前者侧重于特定的已知代谢物，后者则分析整个代谢组，包括未知化合物。当前高通量分析方法（如气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）和核磁共振（NMR））的发展和利用已经鉴定出大量的初级和次生代谢物。代谢组分析的基本缺点在于无法分离复杂的代谢物混合物，同时无法为高通量分析检测和定量数千种代谢物。此外，一些代谢物含量较低。
初级代谢物是用于或由基本分子过程（如光合作用）产生的大分子（糖、氨基酸、有机酸、脂质等）。同时，次生代谢物（类黄酮、羟基肉桂酰衍生物、酰化糖苷、谷胱甘肽等，以及植物激素）是在响应生物和非生物胁迫（如热、干旱、感染和食草动物取食）时触发产生的，作为固着植物适应生存的不可或缺的策略。据估计，植物间大约有8000种常见的初级代谢物，但次生代谢物可能多达一百万种，其中大多数是独特的，仅由相似谱系的植物共享。由于它们在植物防御和适应中的特殊作用，次生代谢物已被创造为专用代谢物。结合基于群体遗传学和自然选择的新的数学模型，已经提出了关于植物化学多样性的假说。需要指出的是，有大量代谢物的具体功能仍然未知。此外，这些工作并未对专用代谢物用于农艺性状的发展提供推断。因此，发现为什么合成如此多消耗能量和营养的代谢物是令人感兴趣的，特别是在野生植物中。可以预见，商业农艺性状的选择应该会减少由此产生的品种的化学多样性。
在所有对商业榴莲进行的组学分析中，代谢组学在果肉上的研究最为广泛。然而，观察到大多数研究集中在刺激性气味上，这从GC-MS的普遍使用可以看出，该方法仅限于揭示小分子挥发物。根据经验法则，含硫代谢物，如乙硫氨酸，是常见的榴莲气味的原因，而其他挥发物，如酯类，则增添了独特香气，从而区分了商业品种。除了挥发性化合物，糖和氨基酸也影响榴莲的香气和风味。已经分析了D200、MK和MT品种中的分布。
需要特别说明的是对除商业D. zibethinus品种以外的其他榴莲物种的研究，特别是那些源自婆罗洲的物种，在东南亚被认为是本土榴莲。这些野生但可食用的物种包括D. dulcis、D. graveolens、D. kutejensis、D. oxleyanus和D. testudinarius。它们在表型上天然多样——从浅绿色到红褐色果皮，黄色、橙色到红色果肉——以及独特但重叠的化学谱。其他代谢组学研究调查了营养成分，例如黄肉D. graveolens中的脂肪酸谱，D. kutejensis和D. lowianus中的类胡萝卜素含量，以及几个马来西亚榴莲品种的类胡萝卜素含量。不幸的是，尽管这些工作对每个地方本土榴莲的代谢物谱提供了宝贵的见解，但由于研究未包括与市场需求高的品种（如猫山王和金枕头）的比较分析，数据很难具有可比性。一些地方榴莲的物种可能被错误鉴定，或者在不同地区有不同的地方名称。这项研究还侧重于导致其刺鼻气味的挥发物。了解有助于风味、颜色和质地的代谢物，可以实现所需果实性状的定向育种，但这仍然难以实现。
多组学整合以全面理解榴莲
多组学整合了各种组学方法，如基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，以实现对生物系统及其相互作用的全面理解。在植物中，多组学技术促进了作物改良，提高了育种效率，并导致了植物信号分子的发现。
猫山王参考基因组草图和猫山王以及金枕头的转录组数据集可在NCBI数据库中公开获取，这为下游分析提供了宝贵的参考。组学整合已应用于榴莲，特别是用于基因组学-转录组学和转录组学-代谢组学分析。一个常见的工作流程包括目标基因的全基因组鉴定，然后进行转录组分析以检测果实或成熟特异性差异表达基因，然后在不同品种间进行定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）验证。
利用这些资源，已经对各类基因家族进行了全基因组鉴定研究。同样，转录组范围的研究已经鉴定出乙烯响应因子（ERFs）、MYB激活因子和生长素响应因子（ARFs）。类似地，由于当前研究强调榴莲果肉的农艺性状，多组学分析致力于描绘果实发育和成熟的机制。这些研究强调了植物激素，即赤霉素、茉莉酸和脱落酸，在果实成熟中的作用，此外还有乙烯和生长素。结合转录因子，发现品种特异的Dof参与生长素生物合成。榴莲成熟的特点是蔗糖、苹果酸、琥珀酸和氨基酸的增加，转录组数据支持了这一点，显示参与糖代谢、糖酵解、TCA循环和氨基酸途径的基因上调。功能研究表明，DzMYB1调控苯丙烷途径和类黄酮生物合成，而DzHD-ZIP1.8控制挥发性硫化合物的产生。总之，这些结果对于绘制由转录因子和植物激素介导的果实成熟调控机制非常重要。
组学在榴莲育种中鉴定遗传标记的应用
遗传标记是特定的DNA序列或变异，用于遗传研究和育种计划中鉴定基因或性状。遗传标记鉴定对于性状选择和遗传作图至关重要。遗传标记主要有两类：经典标记（形态学、细胞学和生化标记）和DNA/分子标记。DNA标记的例子包括扩增片段长度多态性（AFLP）、限制性片段长度多态性（RFLP）和单核苷酸多态性（SNP）。
代谢组学分析是榴莲育种计划中的强大工具，因为它有助于识别与特定或理想性状相关的关键代谢物。例如，D. kutejensis由于硫和酯类化合物水平低于D. zibethinus而具有较温和的香气。此外，负责金枕头榴莲香气的四种关键含硫挥发物是乙硫醇、甲硫醇、1-丙硫醇和硫化氢。天冬酰胺和半胱氨酸可以作为确定榴莲成熟度的潜在生化标记，并分别用于VSC生产。这些代谢物可以作为生化标记，用于选择具有最佳性状组合的优良育种系。
与经典标记相比，DNA标记因其多态性高、易于检测、环境稳定性好和重现性高而更受青睐。在榴莲中，已在地方性榴莲龟榴莲中发现了简单序列重复（SSR）标记，而来自公共数据库的商业榴莲RNA测序数据中已鉴定出推定的干旱响应基因的InDel标记。抗病基因类似物（RGAs）的鉴定，可能在植物病原体防御中发挥作用，为开发DNA标记以选择具有增强抗病性的榴莲品种提供了潜力。例如，与两个易感品种相比，榴莲品种普曼尼对Phytophthora palmivora表现出最高的抗性，这可能是由于几丁质响应蛋白、RUN1、RPV1和RGA4编码基因的高表达。此外，根据DzDof2.2和CYP基因（CYP88和CYP707）的差异表达水平，可用作DNA标记，这些基因的表达水平差异导致了榴莲品种间成熟速度和采后成熟速度的变异。
采后加工
榴莲是一种呼吸跃变型果实，在室温下保质期短，通常为2-5天。为了延长其储存时间并保持品质，已应用了几种方法，包括加热和盐渍（以制作tempoyak）、冷冻、冷冻干燥和喷雾干燥。这些加工技术不仅影响果实的寿命，还改变其代谢物组成，特别是其挥发性化合物，这些化合物在榴莲的独特香气中起着关键作用。值得注意的是，成熟榴莲果肉拥有最高水平的γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-EC）和相当多的谷胱甘肽含量，但这些水平在加工产品中显著降低。
不同的加工方法显著影响榴莲的挥发性成分。例如，加热和盐处理降低了金枕头中的硫挥发物。类似地，发酵减少了硫挥发物，同时产生了新的酯、醇和羧酸，从而改变了最终的香气特征。用Pediococcus acidilactici UP02发酵的Tempoyak表现出非硫化合物、非挥发酸度和有机酸水平的增加。此外，榴莲中的代谢物谱受品种差异和收获年份的影响，为采后质量管理增加了另一层复杂性。
储存温度、持续时间和化学处理也在榴莲的挥发性成分中起着关键作用。在D24品种中，酯类化合物在4°C储存1周后显著减少。此外，对金枕头的化学处理（乙烯利和1-MCP）暂时抑制了含硫挥发物，这些挥发物在裂开后恢复。然而，在查尼品种中，1-MCP处理抑制了硫的产生，而乙烯利在裂开后增强了硫的产生。
冷冻干燥和喷雾干燥等干燥方法也会导致榴莲挥发物的显著损失。冷冻干燥30小时导致关键挥发性化合物损失78-95%，干燥时间延长则损失更大。喷雾干燥导致挥发性损失甚至高于冷冻干燥。添加阿拉伯胶在喷雾干燥榴莲粉中提供了最高的挥发性保留。除了影响代谢物谱外，冷冻还影响猫山王榴莲果肉的蛋白质谱，储存1年后，15种蛋白质下调，3种蛋白质上调。
挑战与展望
榴莲基因组测序面临几个挑战，包括其巨大的基因组大小（约1 Gb）、重复DNA元件的存在、多倍体性和高昂的测序成本。此外，大数据复杂性使基因组组装更具挑战性。因此，大多数榴莲测序工作依赖于成本效益高的短读长测序。迄今为止，只有来自马来西亚的猫山王和来自泰国的干尧使用了长短读长测序组合进行了测序。这些参考基因组为未来的比较基因组学研究提供了宝贵的资源。
除了基因组测序，整合多组学方法，如基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学，可以全面了解榴莲性状背后的分子相互作用。目前，仅报道了三项网络分析。网络分析已应用于果实成熟，有助于识别调控代谢的核心基因，并能够构建调控网络模型。在榴莲中进行类似分析可以揭示调控关键途径的调控机制，以及解决榴莲种植中气候变化和疾病爆发等挑战。
与农业利益相关者的合作也至关重要。他们在管理气候变化、害虫控制和杂交育种选择方面的实地经验可以显著促进优良榴莲品种的培育。此外，结合人工智能（AI）和机器学习（ML）可以增强榴莲质量预测、分类和疾病管理，从而改善种植和商业化努力。
目前，大多数组学研究集中在商业榴莲上，而对地方榴莲的研究仍然有限。对地方榴莲的研究主要考察了理化、植物化学和营养特性，以及化学组成，这些特性有助于感官属性。然而，婆罗洲本土榴莲品种的遗传潜力在很大程度上尚未被探索。需要对这些地方品种进行基于组学的遗传谱分析和表征，以发现其隐藏的遗传宝藏。这样的研究将支持旨在为未来栽培开发优良榴莲种质的育种计划。
榴莲品种通过无性繁殖，将优良树木的接穗嫁接在由种子种植的砧木上，而不考虑其品种。嫁接的树木结果要快得多，大约7年，而种子生长的树木需要约15年。由于这个漫长的成熟时间，传统杂交所需品种是费力的，这又因其自交不亲和性、夜间开花和仅由蝙蝠进行的翼手媒授粉而加剧。通过种子进行有性繁殖很少用于优良品种，因为有性繁殖通常产生不同表型的后代。因此，可以预测每个国家的品种收集可能仅源自少数个体。这意味着优良品种是从野生中选择的自然多样化品系，由农民杂交育种那些携带有利农艺性状的个体。因此，泛基因组分析可以鉴定存在/缺失变异（PAVs）和结构变异，从而剖析不同品种在开花时间、胁迫耐受性甚至对植物病原体抗性等复杂性状。婆罗洲的野生榴莲比栽培榴莲具有更多样化的表型，特别是在果肉颜色、质地、风味、刺激性以及果壳的形状、颜色、大小、刺感和开裂方面。这代表了巨大的基因组多样性，值得对泛基因组以及表现这些独特性状的基因/蛋白质调控网络进行详细研究，以用于保护和商业化目的。
代谢组最接近基因型的表现，因为其表型是可观察和可测量的。当相同的植物在不同的农艺实践下对生物和非生物胁迫做出不同反应时，这可能会偏离。例如，种植在岛屿东南亚（如马来西亚和印度尼西亚）的榴莲将面临热带季风气候，该气候由交替的雨季和旱季组成，降雨和湿度相对稳定。在马来西亚，每日温度范围在25至32°C之间，年平均降雨量从2000毫米到4000毫米不等。大约15天的短暂干旱期会在50天后诱导榴莲树开花。据报道，年降雨量超过3000毫米会减少榴莲的产量。而位于大陆东南亚的国家，如泰国和越南，将经历更极端的热带草原气候，有更热和更干的季节。同样，中国海南岛也有热带季风气候，但平均温度相对较低（范围从17到28°C）。此外，大多数榴莲树已经种植了几十年在天然丘陵地区，那里不需要灌溉系统，而现代果园的树木种植在人工建造的高垄上并配有灌溉。结果树的树龄范围可以从7年到几十年。在这些条件下，因此可以推测相同品种的果实表现出表型可塑性，但尽管存在这种现象，尚无研究调查这一现象。以越南种植猫山王为例。MK源自马来西亚。当它在越南种植时，据报道高达30%的收获果实果肉变硬。这表明需要采取缓解措施来改善灌溉、施肥或其他农艺管理，以增强植物对环境胁迫的耐受性或适应性。为了确保果实质量的一致性，重要的是解读这些表观遗传和环境效应（表观基因组），这些效应特别是由触发基因表达（转录组）及其产生的代谢物组（代谢组学）的植物激素和转录因子介导的，通过多组学方法。
在采收和采后实践方面，马来西亚和印度尼西亚的榴莲允许在树上成熟
