《Microchemical Journal》：Development of an integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for comprehensive analysis of the one-carbon metabolome and DNA/RNA methylation in plasma
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本研究开发并验证了一种集成液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台，可同步定量分析血浆中21种一碳代谢物和9种DNA/RNA甲基化标志物，优化了色谱分离和质谱检测条件，为结直肠癌（CRC）代谢-表观遗传学轴研究提供新工具。
Juan Li|孟雪 Liu|曼尼 He|英 Liu|朵 Chen|洪民 Liu
中国教育部代谢失调与食管癌预防治疗国家重点实验室、先进药物制备技术重点实验室、河南省药物质量与评价重点实验室，郑州大学药学院药物发现与开发研究所，河南450001
摘要
一碳（1C）代谢是一个基本的生化网络，为关键的细胞过程提供必要的甲基供体，包括DNA和RNA的表观遗传调控。为了能够直接同时研究临床样本中的这一功能轴，我们开发了一种集成液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台，用于同时定量人体血浆中的二十一种1C代谢物和九种DNA/RNA甲基化标记物。这种方法整合克服了在单次运行中分析来自相互关联途径的化学多样性分析物的挑战。色谱分离采用了互补的HSS T3和BEH Amide柱进行优化。验证后的方法表现出优异的灵敏度，定量限（LOQ）范围为0.1–50.0 ng/mL。验证研究显示了良好的精密度（RSD <14.2%）和准确性（范围从89.6%到114.7%），符合可接受的生物分析标准。将该平台应用于结直肠癌（CRC）患者的血浆后，实现了对一碳代谢和DNA/RNA甲基化的系统级分析，揭示了表明代谢-表观遗传轴功能失调的独特共改变模式。
引言
结直肠癌（CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一。全球范围内，CRC是第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因[1]。CRC诊断的中位年龄为67岁，大约10%的病例发生在50岁以下的患者中。人群归因分数分析表明，超过50%的CRC发病率和死亡率与可改变的生活方式因素有关，特别是烟草使用、不健康的饮食模式（例如高加工肉类消费、低纤维摄入）、过量饮酒、缺乏运动和肥胖[2]。开发可靠的CRC风险预测生物标志物对于识别高风险人群至关重要。这样的生物标志物将使针对性的预防策略成为可能，包括生活方式的改变、风险因素的降低以及针对特定人群的个性化筛查方案。
一碳（1C）代谢是一个分区的生化网络，它生成并转移叶酸激活的一碳单元，以支持三个基本的生物过程：（1）大分子生物合成，（2）通过DNA/RNA甲基化的表观遗传调控，以及（3）维持细胞的还原平衡[3]，[4]。1C代谢的失调已被认为与多种病理状况有关，尤其是癌症、心血管疾病和神经退行性疾病[5]。1C代谢网络由三个相互关联的途径组成：叶酸循环、蛋氨酸循环和转硫化途径[6]。该系统提供了对基本生物过程至关重要的甲基，特别是通过DNA/RNA甲基化的表观遗传调控。蛋氨酸循环生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），这是仅次于ATP的第二丰富的细胞辅因子。SAM依赖的甲基转移酶利用这种辅因子来介导多种生物分子的甲基化，包括DNA、RNA、蛋白质和脂质，从而调节基本的细胞功能[7]，[8]。
DNA/RNA甲基化是一种关键的表观遗传修饰，在肿瘤发生和进展中起着关键作用。异常的甲基化模式经常在早期肿瘤发生过程中出现，这使它们成为早期癌症检测的生物标志物[9]。作为最广泛研究的表观遗传机制，DNA甲基化与多种病理背景下的基因沉默有很强的相关性，包括各种癌症、心血管疾病和神经精神疾病[10]。越来越多的证据表明，RNA甲基化与其DNA对应物类似，积极参与调节RNA代谢和加工，影响可变剪接、转录稳定性和翻译效率[11]，[12]。
液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）已成为分析内源性代谢物的金标准，因为它具有高灵敏度、特异性和处理复杂生物基质的能力。Guiraud等人[13]开发了一种高通量且同时定量的方法，用于分析血浆和脑脊液中的17种同型半胱氨酸-蛋氨酸循环代谢物和辅因子。Adaikalakoteswari等人[14]开发了一种LC-MS/MS方法，可以在单次运行中测量五种1C代谢物（SAM、SAH、蛋氨酸、同型半胱氨酸和甲基丙二酸（MMA），检测限（LOD）为0.081–46 nmol/L。Yao等人[15]开发并验证了一种快速、灵敏且准确的UPLC-MS/MS方法，用于定量八种甲基化核苷，2’-O-甲基胞苷的水平显示出作为糖尿病视网膜病变的诊断标志物的潜力，其显著性值（p < 0.01）。目前的LC-MS/MS方法主要通过针对孤立的途径（如叶酸循环或蛋氨酸循环）或有限的甲基化核苷集来提供1C代谢网络的片段化视图[16]，[17]，[18]。这种方法忽略了一个关键的分析挑战：在整个1C代谢网络中整合定量底物、中间体和功能产物。因此，它无法捕捉从营养输入（叶酸）到核心代谢枢纽（蛋氨酸循环）再到表观遗传终点（DNA/RNA甲基化）的一碳单元的动态流动。这一差距大大限制了阐明通过甲基化调控基因表达和细胞功能的生化相互作用的能力。
由于化合物的结构多样性、浓度范围广和固有的不稳定性，在血浆中对1C代谢组及其相关甲基化产物进行全面分析存在重大分析挑战。在这项研究中，我们开发并验证了一种快速且灵敏的LC-MS/MS方法，用于定量血浆中的二十一种1C代谢物和九种DNA/RNA甲基化标记物。使用HSS T3和BEH Amide柱的组合系统，并在多反应监测（MRM）模式下进行MS/MS检测，实现了目标分析物的有效分离。经过全面的方法学验证后，我们将开发的LC-MS/MS方法应用于CRC患者和健康对照者的血浆样本分析。这种稳健的方法为研究临床研究中一碳代谢动态与功能性DNA/RNA甲基化状态之间的复杂联系提供了全面的工具。
章节摘录
人类样本和伦理
血浆样本来自郑州大学附属医院的52名结直肠癌患者和80名健康对照者。研究方案已获得机构伦理委员会的批准（批准编号PR (AG) 170–2015和PR (AG) 434–2019），并在样本收集前从所有参与者处获得了书面知情同意。
化学品和试剂
二十一种1C代谢标准包括甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、蛋氨酸（Met）、半胱氨酸（Cys）、牛磺酸、色氨酸（Try）
质谱条件的优化
为了优化MRM参数并实现每种分析物的高灵敏度，将移动相A和B（含有0.1%甲酸）的50:50混合物与注入溶液结合使用T型连接器来模拟样品分析期间的色谱条件。在正检测模式下优化了每种分析物最丰富跃迁的锥电压和碰撞能量。优化过程从进行初级质谱（MS1）开始
结论
我们开发了一种灵敏且可靠的集成LC-MS/MS平台，用于测定人体血浆中的二十一种1C代谢物和九种RNA/DNA甲基化标记物。利用互补的HSS T3和BEH Amide柱系统以及MRM检测，该方法实现了这些化学多样性分析物的有效分离和可靠定量。将该方法应用于CRC患者和健康对照者的血浆后，据我们所知，这是首次实现系统级别的
CRediT作者贡献声明
Juan Li：概念化、形式分析、项目管理、撰写——初稿、撰写——审阅与编辑、研究。Mengxue Liu：数据管理、研究、方法学、验证。Manni He：方法学、验证。Ying Liu：形式分析、可视化。Duo Chen：可视化、数据管理。Hongmin Liu：项目管理、撰写——审阅与编辑、监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号U21A20416）；国家药品监督管理局重点实验室项目（编号KF202405）；国家重点研发计划（编号2024YFC3607500）的支持。
