通过双链特异性核酸酶辅助循环技术和 flap 内切酶 1 驱动的 DNA 步进级联扩增方法，对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中 lasR 基因转录进行荧光测定

《Microchemical Journal》：Fluorometric determination of lasR gene transcription in Pseudomonas aeruginosa via duplex-specific nuclease-assisted recycling and flap endonuclease 1–driven DNA walker cascade amplification

基于发酵木耳乙醇提取物，本研究通过亲和超滤质谱（AUF-MS）、分子对接、酶动力学及动物模型验证，筛选出四个XO抑制剂（水杨苷、羊毛甾醇、欧山金酮和槲皮素），证实其可同时降低血清尿酸、抑制关节炎症及保护肾功能，为天然抗痛风药物开发提供新策略。

　　

作者：周洋、刘玄林、孟瑞、孙瑞军、陈明、李赛楠、刘春明、张玉琪

长春师范大学中央实验室，中国长春市北长吉路677号，邮编130032

摘要

从天然产物中分离生物活性成分仍然是药物发现过程中的限制步骤。因此，我们建立了一个完整的流程，将色谱法、质谱法、计算机模拟和体内验证相结合，从Inonotus obliquus的乙醇提取物中筛选黄嘌呤氧化酶（XO）抑制剂，并量化其抗痛风潜力。亲和超滤质谱法首先捕获了与XO结合的配体；随后的对接实验和200纳秒分子动力学模拟验证了酶的稳定结合。酶动力学研究表明，这些抑制剂的IC50值较低（分别为贝特林18.10 μg/mL、羊毛甾醇24.21 μg/mL、奥斯蒙德酮29.06 μg/mL和槲皮素20.19 μg/mL），并明确了抑制机制。在患有高尿酸血症和急性痛风性关节炎的小鼠实验中，这四种化合物同时降低了血清尿酸水平，抑制了关节炎症并保护了肾功能。因此，该提取物通过“降尿酸/保护肾脏/抗炎”三重机制发挥作用，显著改善了高尿酸血症和急性痛风性关节炎的核心症状。这种方法能够快速便捷地从Inonotus obliquus乙醇提取物中筛选和分离潜在的XO抑制剂，为开发基于药用植物的抗痛风药物提供了新策略。

引言

Inonotus obliquus（担子菌门，伞菌纲，Hymenochaetales目，Hymenochaetaceae科）是一种多孔菌，原产于北纬40°至50°之间的北方森林，包括俄罗斯部分地区、日本北部以及中国的长白山和大兴安岭[1]、[3]。这种具有相当药用价值的稀有真菌含有多种生物活性成分，如三萜类和黄酮类化合物，具有强烈的抗炎作用[4]、[5]。然而，国内外对Inonotus obliquus活性成分的研究主要集中在多糖化合物上，对其三萜类和黄酮类化合物治疗痛风的作用研究相对较少。因此，对Inonotus obliquus乙醇提取物治疗痛风的作用机制进行基础研究，并在分子水平上探索其抗痛风机制，具有重要的实际意义。

痛风本质上是一种炎症性关节疾病，当长期高尿酸血症（HUA）导致单钠尿酸（MSU）晶体在滑膜组织周围沉积时发作[6]、[7]。当尿酸（UA）的溶解度阈值被超过时，这些晶体就会形成，从而引发急性关节炎症。临床上，这种从无症状的HUA到明显的滑膜炎的转变定义为急性痛风性关节炎[8]、[11]。这一过程由XO催化，XO是一种多功能钼-黄素-铁酶，它催化嘌呤的氧化反应，决定了可结晶的尿酸量，进而引发疾病。XO将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，后者再转化为尿酸。XO位于嘌呤代谢的瓶颈处；当其活性升高（在肾功能衰竭时尤为常见）时，血清尿酸水平随之上升，导致尿酸结晶并沉淀[12]、[16]。因此，抑制这一关键酶反应是减少过量尿酸和缓解痛风炎症的主要途径。

亲和超滤质谱法（AUF-MS）利用亲和色谱的原理：让目标酶捕获配体，过滤掉非结合物，然后温和地分离保留的复合物以进行直接质谱鉴定。最终，质谱法确定释放的配体，从而从复杂的混合物中直接识别出具有酶活性的候选物质[17]、[20]。作为一种常用的天然产物筛选方法，该方法结合了一步结合、快速过滤和质谱检测，实现了简单、高效且可扩展的高通量筛选。分子对接利用化学计量评分函数模拟小分子与蛋白质的相互作用力，并预测结合构象。作为一种经过充分验证的药物发现工具，这种方法现在被广泛用于先导化合物的筛选和鉴定，因为它直观、方便且成本低廉[21]、[24]。酶反应动力学研究底物转化的速度及其调控因素，从而揭示了催化反应的中间体、途径和分子机制[25]、[26]。这种方法为阐明药物与酶之间的相互作用机制提供了实验支持，对生物化学、生物技术和酶的实际应用具有重要意义。

随后，我们在与痛风相关的动物模型上进行了研究，建立了高尿酸血症动物模型和急性痛风性关节炎动物模型。高尿酸血症是指血清尿酸水平超过其溶解度阈值的情况，如果持续存在，将为痛风和其他系统并发症奠定生化基础[27]、[28]。尿酸是人类嘌呤代谢的最终产物，任何对限速酶XO的调节都会加速嘌呤的转化，导致尿酸过量产生，其溶解度超过阈值后会在关节周围组织中结晶，从而引发急性痛风性关节炎[29]、[32]。

急性痛风性关节炎始于针状单钠尿酸（MSU）晶体在关节内及周围的沉积。这些晶体作为强烈的颗粒刺激物，刺激滑膜膜和驻留的免疫细胞，引发强烈的炎症级联反应。由此产生的促炎介质（如TNF-α、IL-1β、IL-6）进一步加剧了滑膜炎，导致痛风发作的典型红肿、肿胀和剧烈疼痛[33]、[35]。痛风通常在夜间发作：通常第一个受影响的关节是跖趾关节，患者会在几小时内感受到剧烈疼痛。患处皮肤发红、肿胀，活动受限，甚至纸张的重量也会感到不适；发热、寒战和全身不适也是常见症状[36]、[37]。

本研究使用AUF-MS方法快速筛选出与XO结合的候选物质，简化了目标分子的分离过程。随后通过分子对接、分子动力学模拟、酶动力学和两种小鼠痛风模型严格验证了其活性和作用机制。这些结果将Inonotus obliquus从传统草药提升为基于证据的候选功能食品，用于治疗痛风及其并发症。通过将严格的体外筛选与体内机制验证相结合，本研究提供了从提取到疗效的完整数据集，为未来的研究和临床试验提供了可靠的基础。这种综合方法为新药和健康补充剂的开发提供了宝贵指导，提高了研发效率，并为整合疗法提供了更多选择（图1）。

实验设备

使用Waters 2695仪器（配备Waters PDA检测器，美国米尔福德）进行高效液相色谱（HPLC）分析，使用SunFire? C18柱（Waters Corporation）。质谱分析使用Q-Exactive Orbitrap?质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）。

实验材料

Inonotus obliquus从北京同仁堂药店（中国长春）购买，并由长春师范大学的刘春明教授鉴定。别嘌醇（纯度≥98%）、黄嘌呤

样品提取与纯化

通过NSGA-II算法优化得到最佳提取条件：酶加载量为1.92%，酶解时间为45.03分钟，固液比为20.37 mL/g，乙醇体积分数为63.97%。在这些条件下，总三萜类和黄酮类的预测平均产量分别为2.690%和5.394%（图S1a）。考虑到实际操作限制，提取条件调整为酶加载量1.9%，

讨论

目前关于高尿酸血症和急性痛风性关节炎的动物模型研究仍面临许多挑战。痛风是一种代谢性疾病，由尿酸在软组织中的沉积引起[38]。目前常用的治疗痛风的药物包括别嘌醇、秋水仙碱和非布司他等[39]、[42]。然而，这些药物具有显著的副作用，甚至会增加死亡率，因此对天然药物的需求日益增加。

结论

总之，本研究从多个角度对Inonotus obliquus进行了系统分析，包括化学成分提取、与痛风相关的动物模型实验、XO抑制剂的筛选以及体外抑制酶活性的机制研究。这为Inonotus obliquus的全面利用奠定了基础，也为相关药物的研发和临床应用提供了参考。

CRediT作者贡献声明

周洋：撰写初稿、正式分析、数据整理、概念构思。 刘玄林：正式分析。 孟瑞：软件处理。 孙瑞军：软件支持。 陈明：软件支持。 李赛楠：撰写、审稿与编辑、资源协调、项目管理、资金筹集。 刘春明：项目监督、资金筹集。 张玉琪：项目监督、资源协调。

知情同意

不适用。

伦理批准

不适用。

资助

吉林省自然科学基金（编号：20240602028RC）

未引用的参考文献

[2], [9], [10], [13], [14], [15], [18], [19], [22], [23], [30], [31], [34], [40], [41], [52], [58]

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢吉林省自然科学基金（编号：20240602028RC）的支持。