《Journal of Eukaryotic Microbiology》：A Practical Approach to Study Uncultivated Protists Using Single-Cell Techniques for Electron Microscopy
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本文针对未培养原生生物（protists）研究中的技术瓶颈，提出了一套创新的单细胞电子显微镜制备方案。该方案通过定制"TEM固定板"和"SEM篮"等简易装置，有效解决了样本丢失、定位困难和定向切片等难题，显著提升了透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）在微观真核生物超微结构研究中的可行性与可重复性，为探索真核生物多样性提供了关键技术支持。
1 引言
原生生物（protists）作为真核生物多样性的重要组成部分，具有广泛的生态功能与形态特征。然而，由于多数种类体型微小（部分物种如<1 μm）且难以培养，其超微结构研究长期受限。高分辨率显微技术如透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）是解析形态特征的关键工具，但传统方法对未培养物种的适用性差，主要存在样本易丢失、定向困难等问题。
1.1 未培养原生生物的电子显微镜研究挑战
未培养原生生物的研究多依赖单细胞分子技术（如单细胞转录组学），但超微结构研究方法进展缓慢。化学固定过程中使用的醛类、锇酸等试剂具有毒性，且溶液交换易导致微观细胞丢失。此外，树脂包埋后难以通过立体显微镜定位细胞（尤其<50 μm），且无法灵活调整切片方向。
1.2 单细胞透射电镜（TEM）的技术难点
TEM样本制备涉及固定、脱水、树脂渗透等多步骤溶液交换，易造成细胞丢失。传统包埋胶囊（如BEEM胶囊）无法满足单细胞的精确定向需求，而扁平包埋（flat-embedding）可通过倒置显微镜追踪细胞位置，实现特定取向切片。此外，化学固定易因pH、渗透压失衡产生伪影，推荐使用PHEM缓冲液（含PIPES、HEPES、EGTA）搭配蔗糖调节渗透压，以提升海洋生物样本的保存质量。
1.3 单细胞扫描电镜（SEM）的优化空间
SEM样本制备虽无需切片，但同样面临固定、脱水过程中的细胞丢失风险。现有方法（如多聚赖氨酸包被盖玻片）缺乏标准化细节，本研究通过定制"SEM篮"（结合微孔滤膜）优化液体交换流程，提升方法的可重复性。
2 材料与方法
2.1 单细胞TEM制备方案
核心装置为"TEM固定板"：将移液器吸头截短为篮状容器，底部打孔（直径0.7–0.8 mm）后固定于聚丙烯培养皿，通过外部溶液交换避免细胞扰动。固定液推荐2.5%戊二醛（PHEM缓冲液+9%蔗糖调节渗透压），锇酸后固定（1%–2%）后经梯度乙醇脱水、 Spurr树脂渗透，最终扁平包埋于培养皿。聚合物树脂块可直接通过倒置显微镜定位细胞，并利用Dremel工具切割、定向粘附于空白树脂块，实现精准超薄切片。
2.2 单细胞SEM制备方案
"SEM篮"由移液器吸头与微孔滤膜（孔径>2 μm）硅胶密封制成，放置于24孔板进行溶液交换。固定后细胞经锇酸处理、乙醇梯度脱水及临界点干燥，最终镀膜观察。该方法成功应用于寄生甲藻 sp.的表面形貌研究。
3 结果
以海洋眼虫 sp.为例，单细胞经TEM制备后清晰显示细胞核、后鞭毛等结构，超薄切片成功捕获前庭区域横断面，清晰呈现轴丝（axoneme）和副轴杆（paraxial rod）的微管阵列。SEM图像中 sp.细胞表面无杂质，形态完整。
4 讨论
相较既往技术（如琼脂糖包埋），本方案通过扁平包埋和定制容器实现了单细胞全程追踪、精确定向与最小化丢失，为未培养类群的超微结构研究提供了标准化流程。该方法已成功应用于多种原生生物（如眼虫、甲藻）的研究，显著提升了TEM/SEM在微观真核生物形态学中的适用性。
