《Small Structures》：High-Fidelity Dehydration and Low-Artifact Scanning Electron Microscopy Measurement of DNA Self-Assembled Nanopatterns
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本文报道了一种通过Ni2+离子修饰实现DNA自组装纳米图案高保真脱水与低损伤扫描电镜（SEM）表征的新方法。该方法通过Ni2+与DNA磷酸骨架反应形成半导体性镍磷酸衍生物，增强样品导电性，无需金属溅射即可直接进行SEM成像，将临界尺寸（CD）测量偏差降低50%，为DNA纳米制造技术提供了无损、高精度的形貌分析方案。
1 引言
分子自组装技术能够构建具有新颖纳米结构和光电特性的材料，在纳米器件制造中展现出巨大潜力。DNA自组装作为一种可编程的“自下而上”纳米加工策略，其临界尺寸可达到7纳米以下，甚至优于极紫外光刻技术。然而，DNA纳米图案在固态基底上的高保真脱水与低损伤形貌计量仍是推动其纳米制造应用的关键挑战。传统的扫描电子显微镜表征通常需要对绝缘性DNA样品进行金属溅镀，这一过程会改变样品的本征形貌和化学组成，引入测量误差。
目前对DNA砖自组装形成的微米级晶体薄膜主要采用三种分析技术：轻敲模式原子力显微镜可获取DNA纳米结构的厚度信息，但受探针侧壁空间限制，难以准确测量高纵横比结构的真实横向尺寸；透射电子显微镜成像需通过负染色和脱水处理，会导致DNA螺旋直径显著收缩，且铀氧化物残留使样品无法用于后续纳米加工；而临界尺寸扫描电子显微镜虽广泛应用于半导体行业，但铂溅镀层会引起线宽展宽、金属沉积不均等伪影，并可能造成结构损伤。
本研究提出了一种针对DNA纳米图案的高保真脱水与低伪影SEM测量方法。以32纳米线宽的平行线-间隙DNA纳米图案为模型系统，通过镍离子处理抑制脱水诱导的DNA图案收缩，同时利用镍离子与DNA磷酸骨架反应形成的半导体性镍磷酸衍生物增强样品导电性和热消散能力，实现无需金属溅镀的直接SEM成像。
2 结果与讨论
2.1 样品制备与SEM成像
DNA晶体薄膜基于DNA砖范式设计，采用32核苷酸的单链DNA作为构建单元，通过四个8碱基长的特异性结合域与相邻DNA砖杂交，形成方形晶格结构。通过DNA模块外延法逐步组装基模块和线模块，获得微米级DNA晶体薄膜。将样品滴铸至单晶硅等基底后，通过梯度乙醇脱水固化。值得注意的是，脱水DNA图案在环境大气中长期存储会因吸湿发生轻微变形。
采用日立场发射SEM的上二次电子探测模式，无需铂溅镀即可直接观察到清晰的平行线-间隙图案，但图像对比度显著降低。SEM内其他探测器因定位、收集角和探测灵敏度的固有限制，无法获得清晰的无溅镀图像。
2.2 抗衡阳离子的影响
通过脱水前引入氯化镍溶液，极性更高的镍离子取代紧密堆积DNA螺旋间的镁离子，增强DNA砖晶格内的静电相互作用，抑制脱水过程中DNA纳米图案的塌陷和变形。镍离子还作为界面桥接层，加强电负性DNA晶体薄膜与弱电负性硅表面之间的静电吸附。
实验表明，含镁离子的DNA图案脱水后线宽增加至14.5±1.6纳米，而镍离子掺入的DNA晶体薄膜线宽为13.0±0.5纳米，更接近其在缓冲溶液中的本征形貌参数。镍离子与DNA骨架磷酸基团形成的镍磷酸衍生物具有半导体特性，能促进电荷从DNA线模块向无机基底转移，在一定程度上维持SEM图像对比度和清晰度。
通过Gwyddion软件进行灰度定量分析发现，增强整体图像对比度可使DNA线模块与基模块的特征对比度从0.38提升至1.54，接近传统铂溅镀DNA晶体薄膜的1.31。而锐度增强仅放大整体图像噪声，无实质改善。
2.3 基底的影响
在单晶硅、热生长二氧化硅/硅、石墨烯-硅和石墨烯-二氧化硅/硅四种基底上评估无溅镀DNA纳米图案的SEM成像性能。引入“边缘斜率”参数反映DNA线模块侧壁二次电子信号的强度变化，较大边缘斜率表明线与沟槽边界更清晰。
四种基底上DNA图案的特征对比度值分别为0.37、0.24、0.66和0.56，与基底导电性顺序一致。Voigt函数拟合得到的边缘斜率值分别为0.08、0.07、0.11和0.10，同样符合基底导电性趋势。石墨烯-硅基底上的DNA图案灰度剖面呈现最显著的双峰分裂，这是DNA线模块顶部边缘场发射效应导致的微小伪影，间接表明DNA纳米图案在高导电性石墨烯表面保持了完整三维形态。
2.4 CD测量精度
比较硅基底上铂溅镀DNA图案与石墨烯-硅基底上无溅镀DNA图案的临界尺寸测量结果。统计分析显示，铂溅镀样品的线宽为12.0±2.4纳米，而无溅镀样品为12.8±1.1纳米，测量标准偏差降低50%。铂溅镀过程中形成的离散金属团簇会产生强度不均的电子散射信号，干扰CD测量；而镍离子处理通过离子渗透在DNA晶格内均匀生成镍磷酸半导体物质，不会形成表面矿化层，能更真实反映DNA纳米结构的形貌。
镍离子作为最佳电正性桥接，促进DNA自组装结构与云母、二氧化硅等电负性基底间的静电吸附。石墨烯通过π电子云吸附阳离子作为固定电负性材料的桥接界面，但DNA晶体薄膜中核碱基的共轭π平面大多垂直于石墨烯基底，π-π堆叠作用过弱，镍离子表现优于镁离子。
2.5 电子束辐照耐受性
在10千伏加速电压和10微安束流条件下，比较60秒连续电子束曝光后无溅镀与铂溅镀DNA晶体薄膜的形貌变化。无溅镀DNA图案在硅、石墨烯-硅和石墨烯-二氧化硅/硅基底上均保持稳定的平行线图案，仅出现轻微的线宽波动。
二氧化硅/硅基底导电性差，导致无溅镀DNA薄膜出现明显碳化和再沉积问题。石墨烯基底的高导电性最小化了对入射电子束的静电排斥，更高效的能量转移加剧脱水诱导的线宽减少。铂溅镀DNA薄膜与石墨烯基底上无溅镀样品的线宽缩减程度相似，表明高导电性固体基底可补偿镍掺入DNA晶体薄膜的低导电性。进一步实验表明，束能是控制DNA晶体薄膜电子束辐照耐受性的关键因素。
3 结论
镍离子掺入DNA脱水方法建立了一种无需金属溅镀预处理的低损伤、便捷SEM测量方法，实现了微米级DNA纳米图案在硅、二氧化硅和石墨烯等基底上的高保真固定，成功制备了32纳米线宽的平行线-间隙图案。省略金属溅镀步骤避免了导电层引入的CD测量伪影，确保SEM前后DNA图案的结构和组成完整性。无溅镀SEM的CD线宽测量统计偏差较传统溅镀方法降低50%，且与反应离子刻蚀、化学气相沉积、原子层沉积等纳米加工工艺兼容。这种无损表征策略有望应用于二维DNA纳米图案和三维DNA-金属纳米粒子组装体的立体成像，为DNA介导的纳米加工工具箱提供关键技术支撑。
4 材料与方法
4.1 DNA砖晶体自组装
基模块单链DNA在TE/Mg2+缓冲液中44°C孵育12小时，39°C孵育24小时；随后加入基模块和线模块单链DNA，38°C孵育48小时，33°C孵育8小时。最终产物储存于4°C反应缓冲液中。
4.2 石墨烯转移至固体基底
硅和二氧化硅/硅晶片经食人鱼溶液清洗。 monolayer石墨烯通过PMMA辅助转移法转移至亲水基底，经丙酮去除PMMA残留后，在300°C管式炉中退火2小时。
4.3 固体基底上DNA纳米图案脱水
DNA砖晶体溶液稀释后滴铸至固体基底，孵育1小时后加入50毫摩尔氯化镍或氯化镁溶液继续孵育1小时。经70%、90%和99.5%乙醇梯度脱水后空气干燥。
4.4 AFM表征
采用Bruker MultiMode 8-HR AFM系统，轻敲模式扫描，步长低于2纳米。
4.5 SEM表征
铂溅镀通过Q150T ES plus系统实现。SEM图像采用日立Regulus 8220 SEM获取，加速电压10千伏，束流10微安，工作距离5毫米。
