利用原子力显微镜和红外光谱技术研究新生儿肝外胆管细胞外基质的亚细胞级力学化学相关性

《Analytica Chimica Acta》：Understanding sub-cellular mechanochemical correlations of the neonatal extrahepatic bile duct extracellular matrix by atomic force microscope-Infrared spectroscopy

电化学传感技术因生物污染和探针不稳定问题受限，本研究设计DL-丝氨酸Y形肽（YPEP）修饰的传感界面，兼具抗污染和酶稳定性。实验表明该传感器在1.0-10 μg/mL范围内对APN检测灵敏，限值0.24 ng/mL，与ELISA结果一致，解决了复杂生物样本中的探针钝化问题。

　　

王玉东|李彦欣|詹银楠|杨杰|张旭新|王磊|罗希良

摘要

电化学传感技术仍面临生物污染和在复杂生物基质中探针稳定性不足的挑战。为了解决这个问题，我们设计了一种含有DL-丝氨酸的Y形肽（YPEP），这种肽结合了抗污染特性和识别效率。我们通过检测人血清中的氨基肽酶N（APN）来验证其应用效果。这种经过肽修饰的传感界面表现出有效的抗污染性能，并增强了对酶降解的抵抗力。在检测APN时，所开发的传感器在1.0 ng·mL^-1到10 μg·mL^-1的线性范围内显示出敏感的响应，检测限为0.24 ng·mL^-1。与临床人血清样本进行比较研究后，发现所开发传感器与标准ELISA方法的结果非常一致。这项工作为开发适用于复杂生物基质的稳健抗污染肽基生物传感平台提供了一种可行的策略。

引言

氨基肽酶N（APN，也称为CD13）是一种依赖锌的金属蛋白酶，在一些关键生理过程中起着重要作用[1]。其表达水平异常通常与某些疾病（如肿瘤、炎症和高血压）的发病和进展有关[2],[3],[4],[5]。因此，在复杂生物基质（如血清）中准确量化APN对于机制研究和临床实践都具有重要意义。目前，APN的检测主要依赖于电化学方法[6]，但生物污染是不可避免的[7],[8],[9]。传感器表面非特异性吸附的物质（例如蛋白质）会不利地影响传感性能，因为它们可能导致传感器失活或信号减弱[10],[11],[12]。因此，构建具有稳健抗污染特性的稳定传感界面对于确保在复杂生物流体中准确检测生物标志物至关重要[13],[14]。

在适合电化学传感界面的抗污染材料研究方面已经取得了显著进展，包括聚乙二醇（PEG）和两性离子聚合物。然而，这些材料在广泛应用中也存在缺点。PEG容易发生氧化降解[15]，而两性离子材料则受溶液pH值和离子强度变化的影响[16],[17]。除了这两种材料外，肽类最近成为有前景的候选材料。它们由通过酰胺键连接的氨基酸组成，具有结构可调性、序列可编程性和优异的生物相容性[18],[19],[20],[21]。蒋的研究团队进行了一系列关于抗污染肽的研究，指出亲水性和电中性是增强抗污染特性的关键因素[22]。受蒋工作的启发，崔及其同事开发了一种新型肽（EESK-SESKSGGGGC），表现出良好的抗污染性能[23]。尽管这些设计的肽具有优异的抗污染性能，但它们在复杂生物环境中容易被蛋白酶降解，这严重限制了它们的实际应用[24],[25]。

为了提高肽对酶降解的抵抗力，研究人员提出了多种方法，其中用D-氨基酸替换L-氨基酸是最直接的方法之一。罗及其同事设计了含有D-氨基酸的抗污染肽[26],[27],[28],[29]。研究还表明，即使被D-氨基酸取代，抗菌肽在体内仍能保持其二级结构和优异的稳定性[30]。最近的研究发现，在肽结构中引入DL-丝氨酸可以通过氢键诱导的水合作用显著抑制β-折叠的形成。这种效应进而提高了肽的水溶性、生物相容性和对酶降解的抵抗力[31]。

在这项工作中，我们将DL-丝氨酸引入Y形肽（YPEP）框架中，使其同时具备抗污染和抗酶降解的能力[32],[33],[34],[35]。实验结果表明，用YPEP修饰的电极界面在全血和血清中都表现出优异的抗污染性能以及稳健的抗酶稳定性。通过检测临床血液样本中的APN验证了这种方法的可靠性，其结果与传统ELISA方法的一致性良好。如图1所示，电极修饰过程和工作原理用图表进行了说明。

试剂和仪器

设计的YPEP序列为CPPPPEKEKEK(DL-丝氨酸)₆-YVEYHLCR，参考肽（PEP）的序列为CPPPPEKEKEK，均由南京源肽生物技术有限公司（中国南京）合成。PEP作为基线对照，用于评估后续引入的功能模块带来的综合性能变化。这两种肽的纯度均超过95%，无需进一步处理即可使用。它们的分子结构和特性已进行了表征。

生物传感器的制备和表征

为了提高电极的导电性和增加其比表面积，通过电沉积方法在电极表面沉积了PEDOT和AuNPs[38],[39]。图1展示了电极的表征结果。如图1A所示，与PEDOT修饰的电极相对光滑的表面相比，沉积了AuNPs的电极表面均匀分布着Au突起（图1B）。进一步对不同层修饰的电极进行了表征。

结论

在这项工作中，我们开发了一种基于YPEP肽的电化学传感界面。所开发的传感器能够灵敏地检测人血清中的APN。实验结果证实，通过在YPEP结构中引入DL-丝氨酸，该传感器表现出增强的抗生物污染能力和长期稳定性。这克服了在复杂生物样本中使用电极时出现的失活技术瓶颈。通过对临床样本的分析

作者贡献声明

李彦欣：撰写 – 审稿与编辑、可视化、方法论。詹银楠：撰写 – 审稿与编辑、可视化、概念化。王玉东：撰写 – 初稿撰写、方法论、实验研究、数据管理、概念化。王磊：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法论。杨杰：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、数据管理。张旭新：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、数据管理。罗希良：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目统筹。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22374085、22174082）和青岛市自然科学基金（编号24-8-4zrjj-7-jch）的支持。