DPPH R f-Shift测定法克服光谱干扰：一种基于TLC的快速、便携式半定量抗氧化剂评估方法

《Analytica Chimica Acta》：DPPH R f-Shift Assay to Overcome Spectral Interference: A Rapid, Portable TLC-Based Approach for Semi-Quantitative Antioxidant Evaluation

抗氧化活性评估中，传统DPPH分光光度法存在颜色干扰、假阴性结果及设备成本高等问题。本研究开发基于薄层色谱（TLC）的DPPH Rf-Shift Assay，通过分离氧化态（DPPH*，紫色）与还原态（DPPH-H，黄色）自由基的极性差异，结合TLC成像系统量化Rf值比值（≥1为活性显著），有效消除颜色干扰。实验验证显示该方法对β-胡萝卜素等 colored抗氧化剂和非 colored抗氧化剂的响应均准确，且灵敏度、成本效益和操作简易性优于现有方法。

　　

加里玛·辛格（Garima Singh）|佩林库拉姆·拉维·迪帕（Perinkulam Ravi Deepa）|普拉巴特·纳特·贾（Prabhat Nath Jha）

印度拉贾斯坦邦皮拉尼（Pilani）比拉拉科技与科学学院（Birla Institute of Technology and Science）生物科学系，邮编333031

摘要：

准确评估抗氧化活性对于食品、制药和生物医学研究中的化合物分析至关重要。传统的检测方法（如DPPH分光光度法）因其简便性而被广泛使用，但这些方法存在假阴性结果、有色化合物的光谱干扰、相对较高的样品用量以及对昂贵仪器的依赖性等局限性。替代方法（包括TLC/HPTLC-DPPH和基于HPLC的检测方法）仅部分克服了这些限制，但在定量或操作可行性方面仍面临挑战。因此，需要一种快速、可靠且不受颜色影响的方法来测定有色及无色化合物的抗氧化活性。

我们开发了DPPH R_f–位移检测法（DPPH R_f–Shift Assay），这是一种基于TLC的技术，通过利用极性差异将氧化态的DPPH自由基（DPPH*）与其还原态（DPPH-H）分离，从而产生可测量的R_f值变化来量化抗氧化活性。抗氧化活性通过TLC文档系统（TLC Documentation System）进行量化，其计算公式为R_fDPPH-H / R_fDPPH*，其中R_fDPPH-H/R_fDPPH* ≥ 1表示具有显著抗氧化活性。使用五种参考抗氧化剂（BHT、α-生育酚、抗坏血酸、吡咯 Gallol红、β-胡萝卜素）以及一种有色非抗氧化剂对照物（合成偶氮染料苋菜红）进行验证后，结果表明DPPH R_f–位移检测法能够准确捕捉浓度依赖性的抗氧化效果。相比之下，传统的基于分光光度法的DPPH检测法由于光谱干扰，会高估有色化合物的抗氧化活性，导致超过100%的清除率结果。DPPH R_f–位移检测法解决了这一问题，提供了清晰且可重复的抗氧化活性定量结果。

DPPH R_f–位移检测法是一种新型、便携且经济高效的方法，有效克服了抗氧化活性检测中的颜色干扰问题。该方法通过在TLC上直接区分DPPH的氧化还原状态，并利用图像分析技术进行定量，从而能够准确评估有色化合物及复杂色素提取物中的抗氧化活性，拓展了食品、制药和天然产物研究的分析能力。

引言

评估抗氧化活性对于理解化合物缓解氧化应激的能力至关重要，而氧化应激是衰老及多种疾病发病机制的关键因素1, 2。在各种检测方法中，DPPH（1,1-二苯基-2-吡啶基肼）检测法因其简便性和可靠性而被最广泛采用3, 4。该检测基于以下原理：在抗氧化剂存在下，稳定的DPPH*自由基会被还原为DPPH-H，导致颜色从深紫色（DPPH*）变为黄白色（DPPH-H），同时吸收峰在约517 nm处降低3, 5, 6（此处“氧化”和“还原”仅指DPPH的化学氧化还原状态，与生物氧化过程无关）[7]。这种颜色变化反映了抗氧化潜力，主要通过紫外-可见光谱法进行检测，尽管也有其他光谱和非光谱方法被探索过。

尽管紫外-可见光谱法具有优势，但其也存在局限性，如DPPH-H的宽吸收带与DPPH*的重叠导致在517 nm处出现误导性读数。此外，反应副产物在类似波长处的吸收也会引入误差2, 8, 9。这些挑战在分析有色抗氧化剂（如β-胡萝卜素[10]、紫花青素[11]和花青素[6, 12]）时尤为明显，因为它们的吸收光谱与DPPH*重叠，使得准确定量变得复杂[13]。为解决这些问题，需要在检测前仔细考虑反应物和产物的吸收特性。高吸收化合物通常需要多次稀释，增加了实验复杂性和误差风险[14]。传统的分光光度法所需样品量较大（约200 μL）[15]，这不仅增加了成本（尤其是对于昂贵的抗氧化剂），还限制了方法的便携性。

非光谱方法（如TLC和HPTLC检测法）利用DPPH作为衍生剂来可视化抗氧化活性。在这些方法中，TLC板上的抗氧化化合物与DPPH溶液反应后，活性斑点在紫色背景下呈现黄白色。虽然这些方法能有效识别抗氧化活性化合物，但在定量方面存在困难，因为DPPH*在板上的分布不均匀，且难以标准化孵育时间[16]。点印迹技术（dot-blot technique，基于TLC/HPTLC-DPPH改进）试图通过将反应混合物施加到TLC板上并使用ImageJ软件分析颜色强度来改进定量，但仍难以准确测定有色化合物的抗氧化活性[17]。基于HPLC的方法虽然避免了光谱干扰，但成本较高且耗时较长[18]。

基于电子顺磁共振（EPR）的DPPH检测法作为一种替代方案，可以直接监测DPPH自由基，而不受光学吸收的影响，从而有效消除颜色干扰。尽管EPR方法具有高灵敏度和准确的自由基定量能力，但由于依赖专用且昂贵的仪器、较大的样品量以及有限的可用性，限制了其在高通量或资源有限条件下的应用[13]。

表1总结了现有DPPH检测方法的主要物理和分析特性，突出了样品要求、便携性、操作简便性以及对颜色干扰或仪器限制的敏感性差异。为克服这些挑战，我们开发了DPPH R_f–位移检测法，这是一种新型、快速且资源高效的方法，并通过有色及无色抗氧化剂进行了验证。

化学试剂

1,1-二苯基-2-吡啶基肼（DPPH*，纯度>97%）购自东京化学工业公司（Tokyo Chemical Industry, TCI, 日本）。本研究中使用的抗氧化剂包括：HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.（印度）提供的吡咯 Gallol红，Yucca Enterprises（印度）提供的β-胡萝卜素，Sigma-Aldrich（美国）提供的α-生育酚，Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.（SRL, 印度）提供的L-抗坏血酸，以及SRL（印度）提供的丁基化羟基甲苯（BHT）。此外，另一种参考化合物苋菜红也来自Sigma-Aldrich。

结果与讨论

系统评估了有色及无色化合物的抗氧化活性，以探讨内在颜色对基于DPPH的抗氧化活性测定的影响，因为已知色素干扰会干扰传统基于吸光度的检测方法[13]。特别是Yeo和Shahidi[13]的研究表明，有色色素可能由于光谱干扰而非真正的自由基清除作用而导致DPPH检测结果出现误差。

基于上述研究……

结论

在本研究中，我们设计、测试并验证了一种改进的DPPH R_f–位移检测法，该方法能够独立于颜色相关光学干扰来评估抗氧化活性。通过有色及无色抗氧化剂的测试，证实了该方法能够可靠地区分氧化态和还原态的DPPH，从而克服了传统分光光度法的局限性。该方法实现了抗氧化活性的半定量评估。

CRediT作者贡献声明

迪帕·P.R.（Deepa P.R.）：撰写——审稿与编辑、数据可视化、验证、实验监督、资源协调、方法设计。普拉巴特·纳特·贾（Prabhat Nath Jha）：撰写——审稿与编辑、数据可视化、实验监督、资源协调、方法设计、实验实施、资金筹集。加里玛·辛格（Garima Singh）：初稿撰写、数据可视化、验证、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思

利益冲突

作者声明不存在任何利益冲突。

数据获取

有兴趣获取数据或需要更多详细信息的研究人员可直接联系通讯作者普拉巴特·纳特·贾博士（电子邮件：prabhatjha@pilani_bits-pilani.ac.in）。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了ICAR-NASF（NASF/MN-7030/2019-20）和BITS-Pilani（皮拉尼校区）的支持。GS获得了PMRF（总理博士研究奖学金），该奖学金由KEMIN South Asia Pvt. Ltd.、SERB - India（科学与工程研究委员会）和BITS-Pilani（皮拉尼校区）共同资助。同时，我们感谢BITS-Pilani的部门提供的实验支持，以及梅克公司（Merck, India）的Hitesh先生在技术上的宝贵帮助。