通过将选择性核磁共振（NMR）光谱与定量核磁共振光谱相结合，并利用数据库匹配技术，对膜荚黄芪（Astragalus membranaceus）中的一种支链淀粉的结构进行了阐明

《Carbohydrate Polymers》：Structural elucidation of an amylopectin from Astragalus membranaceus by integrating selective and quantitative NMR spectra with database matching

中性多糖APS-N通过整合高分辨率NMR技术、数据库匹配及qNMR定量分析，完成结构解析。首先利用DQF-COSY和TOCSY/HSQC-TOCSY确定单糖残基A-H，通过自编R脚本与1929种糖残基数据库比对，结合HMBC、ROESY及HSQC-ROESY验证糖苷键模式，最终实现完全结构鉴定。

　　

张俊寅|李彩红|杨宇|邓亚玲|江鑫|朱仲彦|顾秀|胡凯峰

中国四川省成都市成都中医药大学西南中药资源国家重点实验室，611137

摘要

由于核磁共振（NMR）信号重叠明显，阐明同聚糖的结构面临重大挑战。在这项研究中，我们通过结合高分辨率、高选择性的NMR技术与经验数据库匹配，阐明了从Astragalus membranaceus中纯化的中性同聚糖APS-N的结构。首先，通过DQF-COSY谱中的八个分辨率良好的H1/H2交叉峰确定了单糖残基A-H。通过TOCSY和2D HSQC-TOCSY实验获得了每个单糖自旋系统的完整¹H和¹³C化学位移，进一步通过1D DREAMTIME TOCSY验证了质子归属，并将其与HSQC谱中的碳对应物进行了匹配。随后开发了一个内部R脚本，通过系统地将¹³C/¹H化学位移对与文献中1929个完全归属的糖残基进行比较来识别A-H残基。结果发现APS-N仅由具有不同糖苷连接模式的葡萄糖残基组成。¹H和¹³C归属通过残基内的HMBC相关性得到了进一步验证。随后，通过HMBC、ROESY和2D HSQC-ROESY谱中的残基间交叉峰归属确定了糖苷连接类型。最后，结合¹H qNMR得到的化学计量比完成了APS-N的完整结构解析。总之，所提出的工作流程为同聚糖的结构表征提供了一种有效的替代方法。

引言

多糖普遍存在，并在许多基本过程中发挥着关键作用，从多细胞生物的发育和功能到细胞与其他细胞、分子或环境的相互作用（Griffin & Hsieh-Wilson, 2022）。由于多糖具有多种药理活性，如抗凝血（Xu et al., 2014）、抗炎和免疫抑制（Lee et al., 2021）以及抗肿瘤效果（Schneider et al., 2015），因此受到了越来越多的关注。此外，由于其特殊的流变学、热学和凝胶质地特性，多糖也被应用于食品、材料和制药行业（Han et al., 2020; Mu?oz Taboada et al., 2024）。多糖在健康和疾病的生理过程以及工业中的重要作用极大地提高了对多糖详细结构表征的需求。

多糖结构多样性丰富。由于单糖的异构性、分支结构的存在以及缺乏发色团或荧光团，多糖的结构表征面临许多挑战。因此，许多分析方法依赖于化学修饰的应用，如水解或衍生化（Harvey, 2011）。传统的多糖结构表征方法包括使用1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）与高效液相色谱（PMP-HPLC）结合的柱前衍生化方法（Jing et al., 2024）进行单糖组成分析，甲基化和GC–MS分析（Meng et al., 2025）确定糖苷键，以及NMR光谱分析（Di Muzio et al., 2022; Speciale et al., 2022; Zhang et al., 2021）。通过完全水解后进行乙酰化并采用GC（或GC–MS）分析单糖组成是一种流行的方法，适用于衍生化后的挥发性化合物。然而，目前可用的每种衍生化方法都有局限性，限制了GC–MS对糖基组成的分析和准确性。例如，醛糖醇醋酸酯衍生化的缺点是无法区分还原后的中性糖和该糖醇的存在。此外，当使用醛糖醇醋酸酯衍生化和GC进行氨基化碳水化合物分析时，早期报告指出这些衍生化化合物由于分子重排而不稳定（Templeton et al., 2012; Ye et al., 2006）。与乙酰化和GC–MS分析相比，HPAEC-PAD不需要衍生化，从而减少了样品制备时间。HPAEC-PAD可以同时测量三种主要的碳水化合物类别（中性糖、氨基糖和尿苷酸）（Clarke et al., 1991）。然而，单糖之间的色谱重叠（例如Rha/Ara和Xyl/Man）仍然是该技术的关键限制（Liu et al., 2021; Nagel et al., 2014）。PMP-HPLC是一种用于分析复杂多糖组成的最成熟的技术之一，常用于多糖中单糖的定性和定量分析。然而，PMP-HPLC主要关注确定单糖组成——即各种单糖的类型和比例——并不提供关于糖苷键模式的信息。实际上，对于表征多糖结构而言，具有特定糖苷键模式的糖残基的类型和比例比单糖种类更为关键。确定多糖中的糖苷连接类型对于多糖结构表征非常重要。确定糖苷连接类型最常用的方法之一是将多糖中的单个糖残基衍生化为部分甲基化的醛糖醇醋酸酯（PMAAs），然后通过甲基化、水解、还原和乙酰化，再进行气相色谱-质谱（GC–MS）分析以识别和量化PMAAs（Sims et al., 2018）。不幸的是，这需要仔细注意细节和丰富的经验来正确解释数据，使得确定每个组分糖残基的连接位置颇具挑战性。不完全的甲基化或水解会影响确定的糖基残基类型或比例的准确性。由于不同的甲基化反应活性，多糖的甲基化程度不足会妨碍连接分析，导致最终分析中完全乙酰化衍生物的比例较高，分支点与末端糖的比例也较高（Pettolino et al., 2012）。水解旨在切断所有糖苷键而不降解释放的单糖。然而，水解和降解的速度受环形式（吡喃糖或呋喃糖）和糖苷键类型（例如α-或β-糖苷键）的影响。因此，最佳水解条件因目标多糖的不同而异（Ernst et al., 2023）。此外，其他因素也会影响糖苷连接的确定，如多糖在甲基化反应中的溶解度、甲基化前的多糖水解（Needs & Selvendran, 1993），以及识别和量化每种单糖衍生物的多种异构体的挑战（Pettolino et al., 2012）。

核磁共振（NMR）光谱是一种强大的分析工具，可用于表征多糖结构，可以直接从完整的、未经衍生的多糖中获取结构信息。NMR光谱可以方便地表征环大小、异头构型、糖残基的糖苷连接位置以及非碳水化合物取代基的类型和位置，从而确定多糖中的各种糖残基及其化学计量比（Gerwig, 2021）。

在这项研究中，从药用植物Astragalus membranaceus中提取并纯化了中性多糖APS-N，并通过高效凝胶渗透色谱（HPGPC）和基质辅助激光解吸/飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析了APS-N的均匀性和分子量。在我们之前的工作中，使用1D DREAMTIME TOCSY确定了APS-N中严重重叠的质子的化学位移（Yang et al., 2025）。在这里，我们提出了一种基于NMR的替代策略，通过结合选择性和定量NMR光谱与经验数据库匹配来阐明APS-N的结构。

材料

A. membranaceus根系来自中国宁夏吴忠市，并由中国成都中医药大学的吕光华博士鉴定。纤维素DE-52购自北京Solarbio科技有限公司（北京，中国）。Sephacryl S-200 HR和Superdex? 75?pg柱购自GE Healthcare（瑞典乌普萨拉）。本研究中使用的试剂详见补充方法S1。

多糖的制备

粗多糖被提取出来

多糖APS-N的制备和分子量表征

从A. membranaceus根系中提取的粗多糖依次通过离子交换色谱和凝胶过滤纯化，得到多糖组分APS-N。HPGPC分析显示出一个单一的对称峰（图S1A），表明APS-N是一种均质多糖。根据葡聚糖标准品的HPGPC校准曲线，确定APS-N的分子量（Mw）和分子量分布（Mn）分别为4.86?kDa和4.28?kDa，多分散指数D为1.14

结论

由于NMR信号重叠明显，阐明同聚糖的结构仍然具有挑战性。在这项研究中，我们提出了一种基于NMR的替代策略，通过结合多个高分辨率的2D NMR、高选择性的1D DREAMTIME TOCSY和¹H qNMR与经验NMR数据库匹配来表征多糖结构。该策略在从A. membranaceus中纯化的中性多糖APS-N上得到了验证，结果表明APS-N仅由葡萄糖残基组成

作者贡献声明

张俊寅：撰写——初稿，数据整理。李彩红：数据整理。杨宇：数据整理。邓亚玲：数据整理。江鑫：数据整理。朱仲彦：数据整理。顾秀：数据整理。胡凯峰：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：22374012, 32171440）、四川省科技计划（编号：2025ZNSFSC0591）、成都中医药大学（编号：242022007）以及国家中医药管理局创新团队和人才培养计划（编号：ZYYCXTD-D-202209）的支持。我们非常感谢中国科学院上海高等研究院的刘志军博士的支持