一种从冷冻的大鼠睾丸细胞中有效回收大鼠精原干细胞的方法

《Cryobiology》：An effective method for recovering rat spermatogonial stem cells from frozen rat testis cells

本研究通过优化解冻方法（DMSO梯度稀释、甜菜碱补充）和纯化策略（EpCAM+磁激活分选），显著提高了冷冻大鼠睾丸细胞中精子发生干细胞（SSCs）的存活率和富集效率，建立了高存活率SSCs的标准化解冻纯化方案。

　　

摘要

睾丸组织的冷冻保存，包括精原干细胞（SSCs），为接受性腺毒性治疗的青春期前男性提供了一种潜在的生育力保存方法。在从冷冻状态中恢复高存活率的睾丸细胞群体时，一个关键但研究不足的因素是SSCs的解冻和纯化方法。在本研究中，我们解冻了大鼠的睾丸细胞，测试了逐渐稀释DMSO、添加糖类以及去除死亡细胞对解冻效率的影响。逐步减少DMSO的使用量和添加海藻糖显著提高了解冻后的细胞存活率。通过磁激活细胞分选（magnetic-activated cell sorting）技术，能够富集出高浓度的EpCAM⁺细胞，其浓度优于使用层粘连蛋白（laminin）进行分离的结果。结合多种方法去除死亡细胞并富集解冻后的大鼠睾丸细胞，我们建立了一种优化的方案。总体而言，我们成功建立了一种从解冻后的大鼠睾丸细胞中富集高存活率SSCs的可靠方法，这可以为从冷冻的人类睾丸细胞中纯化SSCs提供参考。

引言

由于新型治疗方法的发展，过去几十年里癌症儿童的存活率显著提高。如今，超过80%的青春期前癌症患者能够存活至成年[13,38]。目前的治疗手段，如化疗和放疗，虽然可以缓解病情，但常常会导致性腺毒性，从而导致部分或完全丧失生育能力[4]。由于青春期前男性的睾丸中不存在成熟的精子，因此精子银行并不适用于这些患者的生育力保存。精原干细胞（SSCs）是一种能够自我更新、分化为精子并传递遗传信息给下一代的成体干细胞。它们是精子生成和男性生育能力的基础。SSCs移植可以在许多物种（包括小鼠[3]、大鼠[14]、山羊[12]、牛[11]、猕猴[10]）的受体中重新启动精子生成过程。此外，在接受冷冻SSCs移植的不孕症患者中也观察到了精子产生的现象[2,37,39]。任何成功的生育力保存策略都需要成功恢复长期冷冻保存的SSCs。

为了在SSCs移植后成功再生精子生成，必须恢复足够数量的SSCs。此外，低存活率的细胞样本不适合进行分子分析，包括单细胞RNA测序。由于睾丸中SSCs的比例较低[34]，因此富集SSCs也是SSCs相关研究的重要考虑因素。不幸的是，冷冻-解冻过程会导致睾丸细胞受到冷 shock、细胞凋亡以及活性氧过度产生的损伤[15]。为了保护冷冻的生殖细胞免受这些损伤，已经开发了改进的冷冻-解冻方法，例如缓慢冷冻[2,16]。同时，也开发了多种冷冻保护剂来帮助冷冻SSCs存活，包括可渗透的冷冻保护剂（DMSO、甘油、乙二醇）[20,24]、不可渗透的冷冻保护剂（糖类）[19]、抗氧化剂[29]和抗凋亡剂[9]。尽管采取了这些措施，但仍然经常观察到SSCs的存活率较低且功能受损。此外，在这些研究中，解冻后的睾丸细胞并未经过SSCs的富集，限制了后续的移植和分子分析。鉴于可用的冷冻睾丸组织或睾丸细胞数量通常有限，从低存活率的冷冻睾丸样本中最大化获取活的SSCs尤为重要。因此，迫切需要建立一种可靠的方案，从低存活率的冷冻睾丸细胞悬浮液中富集高存活率的SSCs。

在这项工作中，我们改进了解冻方法，并使用冷冻的大鼠睾丸细胞评估了不同方案的SSCs富集效果，最终建立了一种从低存活率的解冻后大鼠睾丸细胞中收集高存活率SSCs的方案。

实验片段

动物实验

所有涉及活体动物的实验均获得了宾夕法尼亚大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。所有实验均按照宾夕法尼亚大学的相应规定进行。

大鼠睾丸细胞的冷冻保存

如先前所述，对携带由金属硫代蛋白启动子（MTLacZ）驱动的LacZ基因的大鼠的睾丸细胞进行了冷冻保存，并对其方法进行了少量修改[2,5]。实验使用了两个月大龄大鼠的睾丸组织。

逐步减少DMSO用量和添加海藻糖可提高解冻后的细胞存活率

传统的冷冻保存方法存在睾丸细胞解冻后存活率低的局限性。为了评估改进细胞恢复程序的潜力，我们测试了四种解冻冷冻大鼠睾丸细胞的方法（图1A）。对于1毫升的冷冻大鼠睾丸细胞，我们分别添加了：① 4毫升DMEM-C溶液；② 先加入2毫升含有5% DMSO的DMEM-C溶液，再加入2毫升DMEM-C溶液（“DMEM-C + DMSO”）；③ 先加入2毫升含有5% DMSO和200 mM海藻糖的DMEM-C溶液，然后再加入2毫升含有200 mM海藻糖的DMEM-C溶液。

讨论

冷冻SSCs或包含SSCs的睾丸组织是一种潜在的青春期前男性生育力保存方法[1,8]。我们已经证明，经过超过20年的冷冻保存后，SSCs仍可以解冻并重新启动精子生成[37]。事实上，灵长类动物中睾丸组织的成功移植[7]促使人类临床试验的开展[43]。然而，传统的冷冻睾丸组织或细胞解冻方法存在细胞存活率低和恢复率低的局限。细胞存活率...

作者贡献声明

Fan Yang：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、数据可视化、方法学设计、研究实施、资金获取、数据分析。Yaru Li：撰写——初稿、数据可视化。Mary R. Avarbock：研究实施。Eoin C. Whelan：撰写——审稿与编辑、方法学设计、研究实施。Ralph L. Brinster：撰写——审稿与编辑、研究监督、方法学设计、资金获取、概念构思。

利益冲突

无利益冲突声明。

致谢

本研究得到了Robert J. Kleberg, Jr. 和 Helen C. Kleberg基金会（RLB）、国家自然科学基金（项目编号82301799，财政年度）、中国博士后科学基金会（项目编号2025M772346）以及江苏省高等教育机构自然科学基金（项目编号23KJB310033，财政年度）的支持。