越南战争期间高度降解骨骼遗骸中的DNA保存状况——特征分析及DNA提取方法评估，用于核SNP基因组检测

《Forensic Science International: Genetics》：DNA Preservation in Highly Degraded Skeletal Remains from the Vietnam War— Characterization and DNA Extraction Evaluation for Nuclear SNP Panel Testing

骨骼DNA降解与NGS靶向SNP分型技术应用研究——以越南战争遗骸为例，通过优化DNA提取方法使70%样本产生有效核DNA，并建立形态学评分系统预测DNA提取成功率，为大规模遗骸身份鉴定提供技术框架。

　　

托马斯·J·帕森斯（Thomas J. Parsons）|阮南（Nam N. Nguyen）|黎东（Dung T. Le）|周芳婷（Phuong T.M. Chu）|武团安（Tuan A. Vu）|陈文武（Vinh V. Tran）|杜丰华（Phong H. Do）|陈灵华（Linh H. Tran）|陈海梅（Ha M. Tran）|裴梅婷（Mai T.T. Bui）|黄翠婷（Thuy T. Hoang）|宁兰婷（Lan T.T. Ninh）|丽莎·范吉尔（Lisa Vangeel）|巴斯·范哈佩伦（Bas van Haperen）|基伦·希尔（Kieren Hill）|阮昭（Chau Nguyen）|贝瑟尼·福赛斯（Bethany Forsythe）|周海华（Ha H. Chu）|黄浩（Ha Hoang）|陈清婷（Thanh T. Tran）

越南科学技术院生物研究所DNA鉴定中心，河内，越南

摘要

近年来，基于下一代测序（NGS）的法医遗传学在目标SNP分型方面的进展为高度降解的骨骼遗骸鉴定开辟了新的机会。这尤其适用于越南战争中失踪的人员，因为DNA的降解以及远亲匹配的需求使得STR检测效果大打折扣。数十万越南战斗人员的下落仍然成谜，但社会仍迫切希望解决这一问题。越南政府致力于开发并应用现代鉴定方法，这需要将基于NGS的SNP分型技术适应越南的具体情况。首要步骤是研究战争遗留骨骼中核DNA的保存状况，并证明能够有效提取核DNA。本文报告了对100个骨骼样本的DNA保存情况进行分析，作为规划大规模数据库驱动DNA鉴定项目的基线。这是一个联合能力建设项目，方法开发始于国际失踪人员委员会（ICMP）的DNA实验室，随后在越南DNA鉴定中心（CDI）进行了正式培训、实施和一致性测试。通过在新调整的DNA提取方法在CDI的全面应用，我们成功从70%的骨骼样本中恢复了人类常染色体DNA。我们还分析了DNA保存情况与骨骼样本7个系统评分的形态特征之间的关系。这些结果支持了在越南开展大规模DNA鉴定的可行性。

引言

1955年至1980年间越南武装冲突中丧生的越南人总数尚不明确[16]，但越南政府（GVN）认为约有48万名北方战斗人员下落不明，其中约18万人未能找到，30万人虽被找到但尚未鉴定（越南政府公告第28/TB-VPCP号，2024年）。这些失踪人员大多安葬在国家纪念墓地。大多数失踪人员与美越战争有关，但也包括与法国的冲突（1950年代）以及后来与柬埔寨和中国的冲突。近几十年来，美国和越南在失踪人员搜救和鉴定方面进行了合作，越南政府协助找回了1000多具美国军人的遗骸，其中约729具已得到鉴定（https://dpaa-mil.sites.crmforce.mil/dpaaFamWebVietnam）。 从20世纪90年代开始，美国政府为鉴定失踪士兵而开发了从降解骨骼中提取DNA的方法，最初侧重于线粒体DNA（mtDNA）的扩增和测序[11]、[5]。如今，这些方法已扩展到使用现代下一代测序（NGS）技术，不仅针对mtDNA和核DNA，还应用于其他美国参与的冲突[32]、[8]。将战争中失踪人员的遗骸鉴定并归还给家属，在越南文化和宗教信仰中具有重要意义[15]、[16]。越南政府致力于开发并应用适当的科学方法进行大规模鉴定（[1]，越南中央党通知，2025年）。最近，国际失踪人员委员会（ICMP）与越南科学技术院（VAST）的DNA鉴定中心（CDI）合作，开展技术能力建设项目，以开发适合越南实际情况的DNA鉴定方法。 针对越南战争失踪人员的系统性DNA鉴定项目将是同类项目中规模最大的[1]。国际失踪人员委员会在前南斯拉夫建立了此类大规模鉴定的模式，基于全国范围内的家庭参考样本收集，并通过高通量检测骨骼遗骸获得的STR谱型进行自动化亲属匹配[17]。在越南案例中，STR检测显示骨骼样本中的DNA降解严重，无法可靠生成STR谱型（ICMP，未发表数据）。此外，由于冲突时间已久，许多参考样本只能来自远亲，因此需要比STR更强大的亲属识别能力。单核苷酸多态性（SNPs）提供了最短的DNA恢复目标，当通过NGS方法获得大量SNPs时，即使与远亲匹配，也能提供强大的亲属分析能力[23]、[29]、[7]。基于这些原因，ICMP决定将针对中等密度SNP面板的目标NGS检测方法[18]、[27]适应越南情况，并与CDI达成联合项目协议，协助将其应用于人类鉴定工作。 这一项目的成功不仅需要实施合适的NGS方法，还需要建立高效的DNA提取方法，以从越南高度降解的样本中恢复核DNA。高效的DNA提取是任何类型成功DNA分型的基础，尤其是对于暴露在恶劣环境条件下的古老骨骼样本。越南的骨骼样本在核DNA恢复方面尤其具有挑战性，这既反映了遗骸的年代，也反映了越南温暖潮湿的气候。在早期的一次尝试中，60个来自越南的困难样本被提交给ICMP进行STR分型，使用的方法在其他情况下对降解样本有效，但均未生成可用于亲属匹配的STR谱型。 成熟的法医DNA实验室经常参与支持其他国家法医实验室能力建设的项目。CDI是一个拥有丰富骨骼DNA提取和mtDNA测序经验的成熟法医DNA实验室[25]。然而，对于这个项目，CDI需要优化的DNA提取方案，并且既没有相应的设备，也没有进行过目标NGS SNP检测的经验。这个联合能力建设项目的设计首先在海牙的ICMP DNA实验室开发并优化了相关方法，证明了这些方法在越南样本上的适用性和性能，然后结合仪器采购、人员培训和重复测试，在CDI建立了这些方法。选择了100个来自越南的骨骼样本在两个实验室之间共享，以便进行优化实验，并在CDI建立方法后评估两个实验室结果的一致性。 多年来，借鉴美国的模式，多个越南政府实验室参与了mtDNA检测，以评估疑似鉴定案例。由于mtDNA的识别能力有限，它不适合越南所需的大规模数据库匹配。但在mtDNA工作中，CDI开发了一种形态评分系统，用于评估骨骼样本的DNA保存“质量”。认识到在实际法医DNA检测前预测检测成功的方法的价值，人们进行了各种尝试，例如使用烧焦的骨骼（[6]），或应用显微镜或光谱方法[21]、[3]。虽然有经验的实验室通常根据骨骼类型、密度、硬度和颜色等特征来大致判断骨骼是否适合DNA检测，但目前尚无广泛应用的便捷分类方法。因此，我们评估了CDI的形态评分系统与核DNA恢复之间的相关性，以评估其在预测DNA恢复方面的有效性。 本文将介绍DNA提取试验的结果以及两个实验室获得的后续DNA提取结果。这有助于了解越南样本中核DNA的保存情况，并证明了在质量控制实验室开发项目中成功引入新的DNA提取方法。我们还介绍了一种新的骨骼样本形态分类系统及其与核DNA恢复的相关性。这项工作为越南骨骼遗骸中核DNA的保存情况建立了基线特征，是建立能够解决美越战争失踪人员问题的NGS SNP检测系统的第一步。

样本

选择了100个样本作为两个实验室共享的代表性研究集。其中54个样本来自中越地区义安省的纪念墓地（NAP墓地），46个样本来自湄公河下游地区的豪江省纪念墓地（HGP墓地）。所有样本都是腿部长骨（股骨、胫骨或跗骨）的横截面，这些部位被认为是DNA恢复的优选来源[10]、[13]、[14]。

结果与讨论

ICMP用于从骨骼中提取DNA的标准方法结合了使用Amicon 100 K滤膜进行完全脱矿和QiaQuick柱子的硅胶结合纯化[2]。虽然这种方法对STR恢复非常有效，但目前的工作重点是基于NGS的SNP分型，其中提高短DNA片段的恢复率对于提高骨骼检测的成功率至关重要，因为在这些骨骼上STR检测通常会失败。使用另一种离心滤膜可以……

结论

当今DNA检测方法的快速进步不断开辟新的研究领域。由于过去几十年骨骼材料中DNA的高度降解，越南战争中失踪人员的DNA鉴定工作一直受阻。冲突时间的推移加剧了骨骼DNA的降解，同时也使得近亲难以找到。此外，冲突的规模庞大，需要……

未引用的参考文献

[9], [28]

CRediT作者贡献声明

黄翠婷（Thuy T. Hoang）：撰写——审稿与编辑，方法学。 陈清婷（Thanh T. Tran）：撰写——审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念构思。 陈海梅（Ha M. Tran）：撰写——审稿与编辑，方法学。 裴梅婷（Mai T.T. Bui）：撰写——审稿与编辑，方法学。 宁兰婷（Lan T.T. Ninh）：撰写——审稿与编辑，方法学。 托马斯·J·帕森斯（Parsons Thomas John）：撰写——初稿，监督，项目管理，资金获取，数据分析，数据管理，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了美国政府的慷慨支持（授权号：72044020IO00001），同时也得到了越南科学技术院（VAST）的部分资助（授权号CSCL08.01/23-24），由陈清婷博士领导。作者感谢这一支持。内容由ICMP和VAST负责，不一定反映美国政府的观点。我们感谢ICMP DNA实验室的工作人员。