《ACS Nano》：Quantitative Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy with DNA-Fluorophore Labels
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本文介绍了一种创新的定量STED显微技术，通过设计携带四个荧光团的DNA/LNA（锁核酸）标记探针，实现了对DNA折纸平台上1-7个靶标分子的精确计数，并在细胞中成功量化了表皮生长因子受体（EGFR）在静息与EGF刺激下的单体/二聚体状态。该方法无需复杂仪器，为纳米尺度蛋白寡聚化研究提供了快速、稳健的新工具。
引言
超分辨率显微镜（SRM）革命性地改变了我们对细胞生物学的理解。受激发射损耗（STED）显微镜作为该领域的主要技术之一，能够实现三维、活细胞、多靶点的超分辨率成像，并已应用于多种细胞生物学系统。然而，利用STED显微镜提取纳米尺度分子组装（如膜受体簇）的定量信息仍处于探索不足的状态。这类问题通常通过定量单分子定位显微镜（SMLM）或使用MINimal fluorescence photon FLUXes（MINFLUX）的直接可视化来解决，但这些方法要么需要复杂分析，要么在可覆盖的三维样本体积上受限，或要求先进的仪器和用户经验。相比之下，STED显微镜基于共聚焦扫描，可以覆盖大的三维体积和不同类型的样本，并且无需计算图像重建步骤，用户友好。挑战纳米尺度蛋白簇定量分析的一个原因是STED图像中单发射体的强度分析可能在整个样本中表现出变化的亮度。一种优雅的方法通过利用时间相关单光子计数（TCSPC）成像实验中的同时光子到达时间，实现了定量STED显微镜，并报告了超分辨分子簇中的分子计数。然而，该方法实验要求高且需要复杂仪器。适用于小分子簇的简单定量STED显微镜方法仍然缺失，而这样的方法将受益于STED显微镜在三维细胞成像中已建立的性能。
本研究受单分子定位显微镜方法DNA points accumulation for nanoscale topography（DNA-PAINT）的启发，采用DNA-荧光团标记进行基于强度的定量STED。DNA-荧光团标记先前已用于STED显微镜并能够规避光漂白。通过在一个DNA链上放置两个荧光团可以增强亮度。基于这些概念，并额外采用锁核酸（LNA），我们设计了携带四个荧光团的DNA-荧光团标记，显示出稳定的强度读数。然后我们使用DNA折纸作为分子平台，可靠地演示了1到7个靶标的分子计数。此外，我们通过测量静息和EGF处理的细胞中表皮生长因子受体（EGFR）的寡聚状态，证明了在细胞环境中的定量STED。这种方法为可在任何可访问的STED设置上实施的定量测量铺平了道路，无需复杂的技术要求。
结果与讨论
首先，我们开发了一种稳健的蛋白质标记策略，以便能够使用STED显微镜通过强度测量获得分子计数。为此，我们设计了一个44核苷酸（nt）的DNA骨架（"对接链"），四个荧光团标记的序列互补的11 nt DNA链（"成像链"）可以与之杂交。为了增加杂交强度，我们将单个核苷酸替换为其锁核苷酸对应物（LNA）。该标记设计的原理是：（i）通过在使用合理激发强度的同时最大化结合位点占据率，实现每个对接链更高的有效亮度；（ii）最小化单荧光团可能发生的荧光强度波动的影响，这种波动会影响分析的准确性。
接下来，我们通过适配先前报道的配备有两种不同对接链序列的DNA折纸平台，测试了DNA/LNA-荧光团探针在基于强度的分子定量方面的性能：第一个对接链（22 nt）位于三个角点（每个位点7个拷贝），形成一个不对称三角形作为标记；目标对接链（44 nt）位于DNA折纸的中心，拷贝数在1到7之间变化。假设DNA折纸结构平坦且订书钉链间距为5 nm，计算得出中心到角的距离范围为27至31 nm，角到角的距离范围为46至56 nm。角点由标记有Abberior STAR 635P的11 nt DNA成像链靶向，折纸中心的目标对接链由标记有Abberior STAR 580的11 nt DNA/LNA成像链靶向。记录了双色STED图像，并解析了DNA折纸的结构。我们定位了每个位点的中心，并测量了DNA折纸上不同位点之间的距离，得出中心到角的距离为36 ± 14 nm，角到角的距离为64 ± 8 nm。使用此DNA折纸作为平台，我们记录了双色STED图像，使用红色光谱通道中的三角形结构作为标识符，并读取中心不同数量目标对接链的荧光强度。为了评估色差可能的影响，我们记录了两个光谱通道中金珠的STED图像，并测量它们的配对距离为4.0 ± 0.1 nm。
接下来，我们设计了6种具有不同数量目标对接链的DNA折纸，并记录了双色STED图像。图像中清晰可见随着对接链数量增加，荧光信号增强。我们对DNA折纸中心目标对接链的荧光强度进行了定量读取，并生成了强度直方图。将每次测量的峰值强度对目标对接链数量作图显示出清晰的线性趋势，y轴截距代表背景强度。强度分布的宽度（通过高斯拟合获得）与对接位点数量的平方根成比例。
我们随后评估了含有不同数量目标对接链的DNA折纸混合物是否可以在同一样品中被区分，以评估我们定量STED方法的分辨能力。为此，我们固定了等量的含有两个或三个目标对接链的DNA折纸混合物，并进行了双色STED显微镜检查。对这些混合物记录的STED图像的视觉检查清楚地显示中心点有两种或三种不同的强度。对于图像分析，我们使用校准数据中的fwhm值，用两个或三个高斯函数拟合强度分布。该分析的结果清楚地检索了相应样品中目标对接链的比例和数量。我们注意到，尽管1x + 2x的强度分布不是双峰的，我们仍然能够识别正确的目标对接链数量和比例。总之，从具有不同数量目标对接链的DNA折纸混合物确定的峰值中心与单个DNA折纸获得的值非常吻合。因此，我们的方法适用于使用STED显微镜图像的强度信息从超分辨簇中提取分子数量。
接下来，我们评估了这种方法是否可用于量化固定细胞中超分辨纳米簇的蛋白质数量。为此，我们选择了表皮生长因子受体（EGFR），这是一种膜受体，据报道在静息细胞中主要是单体，并在配体结合后形成二聚体。瞬时转染表达EGFR-ALFA-mEGFP的CHO细胞用两种纳米抗体标记：第一种标记有Abberior STAR 635P并靶向mEGFP；第二种携带单个44 nt目标对接链并靶向ALFA-tag。对静息和EGF处理的细胞进行了双色STED显微镜检查。对于定量分析，Abberior STAR 635（靶向GFP）的荧光信号作为参考信号，结合到目标对接链上的Abberior STAR 580（靶向ALFA-tag）的荧光信号用于定量分析。这种两步法减少了非特异性信号对分析的贡献，如果只使用单一标记则可能出现这种情况。静息细胞的强度分布显示双峰分布：第一个峰在2.0 ± 0.1 au，对应于没有结合ALFA-tag靶向纳米抗体时的背景信号；第二个峰在7.0 ± 0.8 au，对应于单体EGFR的"真实信号"，与在DNA折纸上单个目标对接链记录的数据相似。此外，这使我们能够确定NB@ALFA-4xP3的标记效率为59 ± 9%。在EGF处理的细胞中，强度分布显示出向更高强度的拖尾，表明EGFR发生寡聚化。假设EGFR仅存在单体和二聚体，我们用3个高斯函数拟合强度直方图，发现强度值为2.7 ± 0.1 au（背景）、6.4 ± 0.9 au（单体和单标记二聚体）和16 ± 3 au（双标记二聚体）。此外，我们观察到标记效率校正后的EGFR二聚体分数为55 ± 7%。
我们使用NB@GFP-STAR 635P信号量化了每面积的EGFR簇密度，在静息和EGF处理条件下分别为5.7 ± 1.3 μm–2和5.4 ± 1.5 μm–2。此外，在未转染的细胞中进行了阴性对照，产生的簇密度分别为0.2 ± 0.1 μm–2（NB@GFP-STAR 635P）和0.4 ± 0.3 μm–2（NB@ALFA-4xP3）。我们发现，将NB@ALFA-4xP3与DNA/LNA-Abberior STAR 580成像链预孵育可显著降低其对细胞的非特异性结合程度。由于STED是一种非常适合记录细胞生物学样本大体积三维超分辨率数据的显微镜技术，我们还对整个CHO细胞中的EGFR进行了体积STED成像。
我们报告了定量STED显微镜，并展示了具有单蛋白分辨率和在超分辨簇中的分子计数。受SMLM中基于DNA的荧光团标记的启发，我们首先设计了一种基于DNA/LNA的标记，携带4个荧光团以实现信号放大。这是基于强度的定量分析的关键先决条件，绕过了单荧光团强度分析的不确定性或对复杂仪器的需求，并实现了单靶标检测。我们展示了对1到7个荧光团标记、混合物以及细胞中EGFR受体寡聚状态的稳健的基于强度的分析。探针设计和基于强度的分析易于在任何基本STED显微镜上实现，无需复杂的技术附加，代表了这种强大显微镜方法的一个有价值的扩展。我们注意到，定量STED分析需要在空间分辨率和强度精度之间取得平衡。虽然更高的损耗强度提高了空间分辨率，但由于有效体积减小和光漂白增加，它们降低了每个分子的光子产率。因此，精确的强度量化受益于适中的STED强度以最大化光子统计，而将高功率设置保留用于解析最密集的簇。
定量超分辨率显微镜的主要应用之一是提取细胞中纳米尺度蛋白簇的寡聚状态。蛋白质组装成纳米尺度簇与功能状态的转变相关，例如受体酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的二聚化、肿瘤坏死因子受体的寡聚化以及T细胞受体的簇集。迄今为止，解决纳米尺度蛋白簇集的显微镜研究大多使用单分子超分辨率方法，特别是那些将单分子发射动力学与分子数量联系起来的方法。然而，这需要复杂的数据分析，由于单分子发射动力学受局部环境影响而存在不确定性，并且受SMLM方法成像特性的限制，例如采集时间长和三维范围有限。其他高端显微镜技术，如MINFLUX和通过顺序成像的分辨率增强（RESI），能够直接可视化密集纳米尺度组装体中的蛋白质。然而，这种令人印象深刻的空间分辨率是以复杂的仪器、非常长的采集时间和受限的观察体积为代价的。
在这里，我们展示了快速定量STED，并以单蛋白分辨率测量了静息和EGF处理的CHO细胞质膜中EGFR的寡聚状态。EGFR激活的分子机制已得到很好理解： upon ligand binding, EGFR dimerizes, thereby initiating transphosphorylation, which in turn recruits and activates key downstream signaling effectors. 先前的工作表明，EGFR在静息细胞中主要是单体，并在EGF刺激后组装成二聚体和更高阶的寡聚体。使用定量STED，我们可靠地测量了单体和高阶寡聚体EGFR的比例，与在类似条件下获得的先前结果非常吻合，后者报告的二聚化比例约为50%。我们注意到，归因于EGFR二聚体的强度峰略高于从单体峰预期的值。我们将此归因于一小部分更高阶的EGFR寡聚体以及一小部分重叠的EGFR二聚体，这些二聚体在STED显微镜下仍未解析。
为了评估我们方法的精确度，我们采用了一种已发表的EGFR表达系统，通过C末端的两个特异性标签mEGFP和ALFA-tag实现EGFR的双色标记。这使我们能够量化抗ALFA纳米抗体的标记效率，这是绝对定量所必需的。我们修改了一个报道的程序，通过额外使用强度信息来确定标记效率，从而将其与手动阈值设置解耦。由此，我们发现抗ALFA纳米抗体的标记效率为59%，高于先前报道的值，这可能与相较于DNA-PAINT更短的照明时间以及因此更少的对接链光损伤有关。此外，我们发现当抗ALFA纳米抗体在与DNA/LNA-荧光团标记预孵育后再添加到细胞样品中时，其非特异性结合大大降低。使用双标记方法因此有两个主要好处：首先，我们的分析集中于真实信号，并最小化了非特异性信号的影响；其次，我们能够直接针对标记效率校正EGFR二聚化比率，这在单色方法中是不可能的。关于EGFR-ALFA-mEGFP构建体中两个标记的紧密接近，标记和位置标记之间可能发生轻微的分子内通过F?rster共振能量转移（FRET）的猝灭，而EGFR二聚体中的分子间FRET由于EGFR单元间距超过10 nm而不太可能发生。尽管这不影响强度分析的线性，但未来的探针设计可以通过优化荧光团对的选择或标记构建体的结构几何来进一步最大化绝对灵敏度。
结论
总之，我们提出了一种使用STED显微镜进行基于强度的分子定量的稳健方法。主要优点是该方法快速、易于实施和分析、不需要复杂的仪器，并且受益于STED显微镜提供的成像机会，如三维、大体积和多色成像。探针设计可以在亮度、颜色和多重靶标方面进行扩展和调整，例如，通过整合DNA条形码，类似于Exchange-STED中采用的策略，允许光谱无限多重化。鉴于该方法的整体简单性，我们预计将其整合到细胞生物学广泛显微镜实验中的入门门槛较低。
方法/实验
DNA折纸的折叠与纯化
使用Picasso设计工具设计矩形DNA折纸结构。DNA链的退火在含有10 nM支架链、100 nM核心订书钉链、1 μM生物素化订书钉链和1 μM对接链柄的40 μL 1× TE缓冲液与12.5 mM MgCl2的混合物中进行。将混合物在65°C孵育5分钟，随后在4小时内冷却至25°C。使用100 kDa MWCO超滤离心管纯化DNA折纸，并储存在FoB5缓冲液中于-20°C。
DNA折纸的固定
将通道玻片的通道充满1× PBS。随后，加入生物素化BSA并孵育15分钟。用1× PBS洗涤3次后，加入链霉亲和素并孵育15分钟。用1× PBS洗涤通道3次，然后加入DNA折纸溶液。孵育20分钟后，用成像缓冲液洗涤通道3次。用于成像时，在实验前立即将20 nM P2和P3成像链稀释在含有500 mM NaCl的PBS中并加入。
细胞培养、EGFR转染与刺激
中国仓鼠卵巢细胞系（CHO-K1）野生型在生长培养基中培养。在转染前2天，将10000个细胞接种在包被有PLL-PEG-RGD的8孔板中。在转染前，用生长培养基洗涤细胞一次，并使用jetOPTIMUS DNA转染试剂进行转染。转染过程按照供应商建立的方案进行。简言之，将0.5 μg含有EGFR-ALFA-EGFP构建体的质粒稀释在50 μL jetOPTIMUS缓冲液中，并与每个孔转染的0.5 μL试剂混合。加入质粒混合物4小时后，用DMEM/F12培养基替换。让细胞表达EGFR 20小时。对于刺激，用100 ng/mL表皮生长因子在37°C处理细胞1分钟，随后用含有0.4 M蔗糖的1× PBS洗涤，并在37°C用4% FA的1× PBS固定15分钟。
免疫荧光标记
对于免疫标记，将CHO细胞在抗体孵育缓冲液中于室温孵育30分钟。用PBS洗涤细胞三次，并在含有FluoTag-x4抗GFP Abberior STAR RED纳米抗体和带有定制设计的4xP3序列的羊驼抗ALFA纳米抗体的抗体孵育缓冲液中以1:100稀释度于室温孵育1小时。用PBS洗涤三次后，用4% FA的PBS后固定10分钟。用于成像时，在实验前立即将20 nM P3-LNA稀释在含有500 mM NaCl的PBS中并加入。
STED显微镜
所有成像实验均使用Abberior expert line显微镜进行，在共聚焦或STED成像模式下操作。
DNA折纸的成像
对于DNA折纸的STED图像采集，样品使用561 nm或640 nm脉冲激发激光激发，并使用具有2D doughnut点扩散函数的775 nm脉冲激光进行损耗。所有激光器的脉冲重复频率为40 MHz，荧光在每个脉冲后750 ps开始、宽度8 ns的时间窗口内检测。使用两个APD在571–630 nm和650–763 nm的光谱范围内收集荧光。图像使用1.0 AU的针孔、线累积次数、像素停留时间和像素大小采集。
CHO细胞的成像
CHO细胞的共聚焦成像使用561 nm和640 nm激发激光进行。荧光在相应的光谱范围内收集。图像使用1.0 AU的针孔、像素停留时间和线累积次数采集。使用50 nm的像素大小。
对于CHO细胞的STED成像，样品使用561 nm或640 nm脉冲激发激光激发，并使用具有2D doughnut点扩散函数的775 nm脉冲激光进行损耗。图像使用特定的针孔、线累积次数、像素停留时间和像素大小采集。
对于CHO细胞的体积STED成像，样品使用561 nm或640 nm脉冲激发激光激发，并使用具有3D top hat点扩散函数的775 nm脉冲激光进行损耗。图像使用特定的针孔、线累积次数、像素停留时间和像素大小采集。
每个图的成像设置总结在补充表中。
基于强度的分子计数
分子计数通过确定4x标记的DNA对接链的强度来进行。使用ImageJ分析图像。使用"Find maxima"插件识别STAR 635P荧光通道中的信号最大值。在识别出的坐标处测量STAR 580通道中的像素强度。使用特定的bin size对强度值的频率进行计数。
在DNA折纸的情况下，使用阈值专门分析靶标特异性信号。强度直方图使用高斯分布进行拟合。在含有不同数量对接链的2或3种不同DNA折纸的实验中，使用相应数量的高斯函数拟合强度分布，并将fwhm值固定为从未混合DNA折纸实验获得的数值。高斯分布的分数使用公式计算。在难以清晰分离的多折纸样品中，通过改变中心和fwhm值来评估拟合强度分布的准确性。
对CHO细胞中EGFR获得的强度直方图使用高斯分布进行拟合。对于静息细胞，使用2个高斯分布。分数使用公式计算。为了确定ALFA-tag靶向纳米抗体NB@ALFA-4xP3的标记效率，我们遵循已发表的程序，并基于文献假设EGFR在静息细胞中主要以单体形式存在。我们通过拟合强度分布来确定背景信号和DNA/LNA-荧光团标记的NB@ALFA-4xP3的分数。由此我们可以计算标记效率LE。
对于刺激细胞，使用3个高斯函数。对于此，将第二个峰的fwhm2固定为在静息细胞中获得的第二个峰的值，并使用公式计算第三个峰的fwhm3值。三高斯拟合的结果包括峰值中心、fwhm和分数。对于主要含有单体和二聚体EGFR的刺激细胞，测量的分数f可以用三个方程表示，仅依赖于校正后的二聚体分数F(Dimer)和标记效率LE。
使用这些，计算校正后的二聚体分数，并取平均值。
簇密度分析
为了提取受体密度，使用ImageJ分析图像。首先，绘制一个包含细胞形状的掩模。使用"Find maxima"插件在掩模内计数受体。密度计算为受体数量除以相应掩模的面积。
