《Transboundary and Emerging Diseases》：Establishment and Application of a Novel Protein Microarray for Serological Detection and Differentiation of Senecavirus A
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本综述系统阐述了新型蛋白微阵列技术在塞内卡病毒A（SVA）血清学检测领域的突破性应用。研究通过理性设计串联抗原（VP2-VP3-VP1和3AB-3C），成功构建了可同步检测结构蛋白与非结构蛋白抗体的高通量平台，实现了感染动物与灭活疫苗接种动物的精准鉴别（DIVA）。该技术具有97.5%的病毒中和试验（VNT）符合率，为猪群疫病监测提供了高效可靠的解决方案。
1. 引言
塞内卡病毒A（Senecavirus A, SVA）作为小RNA病毒科塞内卡病毒属的唯一成员，自2002年在美国首次发现以来，已在全球范围内呈现地方性流行态势。该病毒引起的囊状病变与口蹄疫病毒（FMDV）等疫病临床症状高度相似，使得实验室鉴别诊断成为疫情防控的关键环节。SVA基因组编码的结构蛋白（VP1-VP3）是中和抗体的主要靶标，而非结构蛋白（NSPs）则为区分自然感染与疫苗接种（DIVA）提供了理想标志物。尽管传统血清学检测方法（如ELISA、VNT）各有优势，但均无法实现多靶标同步检测。蛋白微阵列技术凭借其高通量、多参数分析能力，为SVA血清学诊断带来了革命性突破。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料与血清样本
研究采用SVA CH-HNXC毒株及IBRS-2细胞系进行病毒培养。血清样本库包含200份经VNT验证的样本（100阳性/100阴性），以及灭活疫苗免疫组和活病毒攻击组的纵向系列样本。为评估特异性，实验还纳入FMDV、PRRSV、PRV等常见猪病原体阳性血清。
2.2. 抗原设计与表达
通过整合B细胞表位预测软件（DNAStar Protean、IEDB）与已发表表位数据，筛选出VP1（aa 5-100等）、VP2（aa 2-103等）、VP3（aa 7-32等）、3AB（aa 1-36等）和3C（aa 4-29等）的优势抗原区域。采用甘氨酸-丝氨酸接头（GGGGS）2连接构建串联基因VP2-VP3-VP1和3AB-3C，在大肠杆菌系统中实现可溶性（VP1、3AB、3C、3AB-3C）或包涵体（VP2、VP3、VP2-VP3-VP1）表达，并通过镍柱亲和层析纯化。
2.3. 微阵列构建与优化
将纯化抗原点样于表面接枝聚二甲基硅氧烷（PDMS）的纳米膜芯片，通过棋盘滴定法优化实验条件：抗原点样浓度0.5 mg/mL，血清稀释度1:50，辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗猪IgG二抗稀释度1:10,000。采用1%牛血清白蛋白（BSA）37°C封闭2小时，血清与二抗孵育时间均为30分钟。
2.4. 临界值与性能验证
基于200份血清的样本/阳性（S/P）比值，通过受试者工作特征（ROC）曲线分析确定VP2-VP3-VP1和3AB-3C的临界值分别为0.651和0.607。通过系列稀释实验、交叉反应性测试及重复性实验（变异系数CV<10%）全面评估微阵列的灵敏度、特异性和稳定性。
3. 结果
3.1. 抗原表达与免疫反应性
SDS-PAGE和Western blot证实所有重组蛋白均具备正确分子量与特异性免疫反应性。串联抗原VP2-VP3-VP1和3AB-3C的免疫反应性显著高于单个蛋白组分，证明多表位融合策略的有效性。
3.2. 诊断性能与DIVA能力
在灭活疫苗免疫猪中，VP2-VP3-VP1抗体与中和抗体同步转阳（免疫后1-2周），而3AB-3C抗体始终为阴性；在活病毒攻击组中，两种抗体均呈阳性，且结构蛋白抗体转阳时间（感染后4-6天）早于非结构蛋白抗体（8-10天）。对40份临床样本的验证显示微阵列与VNT总符合率达97.5%。
3.3. 动力学特征与临床应用
VP2-VP3-VP1抗体可作为早期感染筛查标志物，而3AB-3C抗体延迟出现的特性使其适用于回顾性监测与DIVA策略实施。微阵列图像清晰显示阴性血清、疫苗接种血清（仅VP2-VP3-VP1阳性）和感染血清（双阳性）的差异化信号模式。
4. 讨论
本研究成功将蛋白微阵列技术应用于SVA血清学诊断，解决了传统方法无法同步检测多靶标的瓶颈。串联抗原设计既克服了单蛋白表位覆盖不足的缺陷，又避免了病毒颗粒制备的批间差异问题。3AB-3C抗体在感染后期的出现规律与文献报道的间接ELISA结果一致，进一步验证了其作为DIVA标志物的可靠性。该平台为猪场疫苗免疫效果评估和疫情监测提供了高效工具，尤其适用于大规模筛查场景。
5. 结论
新型SVA蛋白微阵列技术具备高通量、高灵敏度和特异性等优势，可同步实现疫苗免疫评价与自然感染鉴别，为动物疫病精准防控提供了关键技术支撑。
