通过分子对接和反向疫苗学方法，合理设计多表位亚单位疫苗，从而分析ORFV病毒蛋白组

《Journal of Molecular Liquids》：Analyzing the ORFV virus proteome through rational development of a multiepitope subunit vaccine using the molecular docking and reverse vaccinology approach

ORFV（传染性口蹄疮病毒）是一种高传染性的人畜共患病病毒，本研究基于免疫信息学方法筛选出病毒两个主要靶蛋白（entry-fusion complex和DNA-directed RNA polymerase）的潜在B细胞、T细胞表位，通过多表位疫苗构建和分子动力学模拟验证其稳定性与结构特性，并发现与TLR4受体高亲和力（?265.85 kcal/mol），为ORFV疫苗开发奠定理论基础。

　　

Sana Naeem|Hassan Ayaz|Mehreen Riaz|Sajjad Ahmad|Taghreed N. Almanaa|Faisal Ahmad|Yasir Waheed

巴基斯坦开伯尔-普赫图赫瓦省斯瓦特大学动物学系

摘要

ORFV（也称为传染性丘疹）是一种主要感染多种野生和家养动物的病毒。这种高度传染性的动物源性疾病对所有从事羊和山羊养殖工作的人来说都是一个重大问题。根据分类学，ORFV属于副痘病毒属。当人们接触到这些动物时，其暴露的皮肤区域通常会出现溃疡。尽管感染人数和症状看起来危险性较低，但这种病毒的致死率仍然非常令人担忧。目前尚无批准的疫苗来减轻这种高度传染性疾病的流行病学和临床负担。因此，我们在当前的研究中利用ORFV的目标蛋白，通过免疫信息学方法设计并制备了一种多表位疫苗。我们使用选择标准测试了ORFV两种致病蛋白中的潜在T细胞和B细胞表位，并将这些表位与适当的佐剂和连接剂结合在一起。MHC簇分析和所选表位的群体覆盖率均令人满意。为了保持三级或四级结构，我们采用了二硫键工程技术。此外，还通过正常模式分析研究了疫苗蛋白的稳定性和动力学特性。免疫模拟研究也取得了重要发现。分子对接显示，该疫苗对Toll样受体-4（TLR4）的亲和力为?265.85 kcal/mol。分子动力学模拟表明，该复合系统的稳定性较好（平均RMSD：7.7 ?；Rg：18.6 ?），某些残基表现出局部灵活性。结合自由能计算（ΔG = ?456.67 kcal/mol，GBSA；?469.56 kcal/mol，PBSA）表明，电静力和范德华力促进了这种高度有利的自发相互作用。我们的研究结果表明，这种疫苗设计可以调节针对ORFV病理生理的免疫反应，从而为实验者提供体内和体外研究的基线。

引言

Orf病毒（ORFV）是一种极具传染性的动物源性疾病，属于副痘病毒属的典型代表，主要影响小型反刍动物，如羊和山羊。最近的COVID-19大流行突显了新兴和再出现的病毒性疾病对二十一世纪公共卫生的重要性[1]。导致传染病再次出现的三个主要因素包括：（1）人类与动物之间互动的变化；（2）环境或生态系统的变化；（3）疾病的发展和突变[2]。为了描述和绘制病原体在地理空间中的分布区域，分布生态学框架关注环境因素及其对病原体传播的影响[3]。ORFV感染会导致生产力显著下降，并可能引发受感染黏膜皮肤区域的继发性细菌和/或真菌感染，从而增加对抗生素的需求并提高抗菌素耐药性的风险。特别是在集约化养羊和养山羊的情况下，这种病毒会造成重大经济损失。发病率和死亡率各不相同，在某些羊群中，发病率可能超过100%[4]，[5]，[6]，[7]。疾病的严重程度受多种因素影响。与再次感染的动物相比，初次感染ORFV通常会导致更严重的病变[8]。不同菌株的致病性也有所不同[9]。当存在外部压力（如感染/管理压力）和免疫抑制剂时，ORFV爆发的可能性更大[10]。

由于ORFV感染经常从动物传播给人类，因此对公共卫生构成严重威胁[11]，[12]，[13]。人类感染后的系统症状包括发热和淋巴结炎症，随后在手背等部位形成炎症性丘疹[14]。ORFV通过适应多种宿主而发展出一系列有助于免疫逃逸的毒力特征。多年来，关于该病毒免疫调节机制的研究非常活跃[14]。虽然该病毒偶尔会感染人类，但它主要影响小型反刍动物，尤其是羊和山羊。虽然自我接种和人际传播较为罕见，但接触受污染的环境或动物来源的物品可能会促进动物源性的传播[15]。人类通常在手、手指和前臂等与动物接触的皮肤暴露区域出现病变[13]。这些动物大多由生活在农村地区的牧民和小规模农民饲养[16]。一种称为“免疫调节诱导剂”的药物已被用于治疗和预防多种动物的免疫调节问题[17]。ORFV的基因组为线性双链DNA，长度为138–140 kb，GC含量较高。其基因组包含诸如DNA导向的RNA聚合酶19 kDa亚基和进入-融合复合蛋白等毒力蛋白[18]。目前尚无有效的药物可以治疗ORFV，因此开发快速准确的诊断方法至关重要[19]。传统的疫苗开发需要识别和研究ORFV，并建立免疫学关联。然而，通过实验方法开发疫苗往往具有挑战性且成本高昂，成功率较低。这些方法还可能干扰人体的补体系统正常功能。本研究旨在应对ORFV带来的严重健康威胁，尽管目前尚无有效的疫苗。

因此，利用先进技术开发基于表位的肽疫苗是目前的研究热点。基于计算机模拟的表位肽疫苗可能对ORFV有效，因为它们可以克服许多缺点，并提供更好的免疫原性和安全性。这些疫苗的有效性主要取决于合适的抗原分子的选择[20]。

本研究的目的是通过分析ORFV的目标蛋白，寻找能够引发体液免疫反应的潜在抗原性和免疫原性表位。从选定的目标蛋白中，我们识别出有前景的表位并制备了疫苗候选物。为了评估该新型疫苗引发免疫反应的潜力，我们对其进行了免疫模拟、密码子优化（以在E. coli中实现最佳表达）以及其他计算研究。

我们对疫苗候选物进行了分子动力学模拟，以评估其动态特性和结构稳定性。最后，为了验证分子间的接触力，我们评估了复合体的结合能以及维持复合体稳定性的所有关键氨基酸残基。为了找到针对ORFV的有效疫苗候选物，我们计划进一步开展实验工作以验证我们的发现，希望这些发现能促进ORFV疫苗的开发。

方法学

本研究旨在设计一种针对ORFV的多表位疫苗，所选表位涵盖了基于表位疫苗的所有关键方面，并结合了免疫信息学方法，详见图1。

蛋白质序列的检索与分析

我们从Uniprot数据库中获取了ORF病毒蛋白组中的两个治疗靶蛋白：进入-融合复合蛋白（Uniprot ID：Q6TVT2）和DNA导向的RNA聚合酶19 kDa亚基（Uniprot ID：Q6TVN9），并以FASTA格式保存。然后使用VaxiJen v2.0在线服务器和TMHMM v2.0服务器评估了这些蛋白质的氨基酸序列，并预测了跨膜螺旋的数量。结果发现这些蛋白质具有抗原性。

讨论

传统疫苗生产过程中使用整个生物体可能导致意外的抗原暴露和过敏反应。相比之下，肽疫苗含有短小的免疫原性片段，能够产生强烈且定向的免疫反应，从而降低过敏反应的风险。为了预防包括科罗拉多蜱热病毒、风疹、流感、天花和甲型/乙型肝炎在内的传染病，疫苗设计正变得越来越重要

结论

含有多种表位的疫苗可以用于治疗癌症和病毒感染。生物计算和免疫信息学技术的最新进展使得这些疫苗的设计和开发更加快速和经济。我们的目标是开发一种专门针对ORFV目标蛋白的多表位疫苗。该疫苗配方包含了有前景的B细胞、CTL和HTL表位。

作者贡献声明

Sana Naeem：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、软件使用、资源准备、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。Hassan Ayaz：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、软件使用、资源准备、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。Mehreen Riaz：初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。Sajjad Ahmad：撰写 – 审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者衷心感谢沙特阿拉伯利雅得国王沙特大学的正在进行的研究资助计划（ORF-2025-632）的支持。