《Marine Pollution Bulletin》：Rapid enrichment coupled with liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the analysis of marine algal toxins
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C18（上）–石墨化碳（下）固相萃取盘首次用于同步富集35种极性差异显著的海洋藻毒素（MATs），检测限低至2.0×10?4 ng/L，辽东湾和北部湾海水样品中检出9种MATs（含首现的19-epi-OA和19-epi-DTX1），总浓度26.12–56.95 ng/L。该方法为大规模沿海水域MAT分布研究提供技术支撑。
Jiuming Wang|Bin Xu|Wei You|Jia Chen|Hua Xu|Jinjuan Xue|Yaxian Zhu|Jianwei Xie|Yong Zhang
中国海洋环境科学国家重点实验室（厦门大学），厦门大学环境与生态学院，厦门，361102，中国
摘要
首次使用C18（上）–石墨化碳（下）固相萃取盘从海水中同时快速富集35种溶解的海洋藻类毒素（MATs），其对数Kow值的最大差异为12.3。富集后的MATs通过液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）进行分析。预处理过程的流速为100 mL/min，海水实现了2000倍的富集效果，目标MATs的回收率超过65.9%。该方法表现出高灵敏度和优异的精确度，检测限低至2.0 × 10?4 ng/L，平均相对标准偏差≤12.8%。使用该方法分析了辽东湾和北部湾的真实海水样本，检测到了多种溶解的MATs。在选定的研究区域的海水样本中检测到了9种MATs，包括gymnodimine、pectenotoxin-2、okadaic acid（OA）、19-epi-OA、dinophysistoxin-1（DTX1）、19-epi-DTX1、homo-yessotoxin、gonyautoxin-2（GTX2）和GTX3。值得注意的是，19-epi-OA和19-epi-DTX1是在中国首次被鉴定出来的。辽东湾和北部湾中溶解的MATs浓度分别为26.12至56.95 ng/L和28.12至51.98 ng/L。本研究提出了一种探索大规模沿海海水中多种MATs分布特性的潜在技术。
引言
海洋覆盖了地球表面的70%以上，在调节全球气候、维持生物多样性以及提供人类生存所需资源方面发挥着至关重要的作用（Talukder等人，2022年）。海洋也是各种污染物的主要汇，会积累和输送这些物质（Li和Meng，2025年）。然而，由于富营养化、气候变化和人类活动的影响，海洋污染事件的频率和强度一直在增加，这引发了人们对海洋生态系统健康和稳定性的严重担忧（Dai等人，2023年；Pierina等人，2016年；Song等人，2022年；Yan，2022年）。在各种海洋污染物中，由有毒海洋藻类产生的海洋藻类毒素（MATs）具有极高的毒性，对海洋生态系统和人类健康构成重大威胁，因此受到了广泛关注（Wang等人，2021年；Liang等人，2022年；Lai等人，2024年）。它们是全球范围内导致中毒事件的原因之一，每年造成超过60,000例人类病例，死亡率为约1.5%（Pires等人，2023年；Daguer等人，2018年；Kim等人，2022年）。已经有许多关于海洋环境中MATs及其对生物体的代谢和毒性影响的研究（Zendong等人，2016年；Wu等人，2020年；Dong等人，2024年）。这些研究为了解它们的生态风险、环境影响以及对人类健康的影响提供了重要的科学依据。MATs包括亲脂性海洋藻类毒素（LMATs）和亲水性海洋藻类毒素（HMATs）。由于极性差异显著，LMATs（对数Kow为2）和HMATs（对数Kow小于-3）通常被分别分析（Liang等人，2022年）。然而，地理位置、气候条件和水文因素影响全球有毒海洋藻类的分布，导致LMATs和HMATs共存，并且海洋环境中的MATs谱型存在动态变化（Kim等人，2022年；Liu等人，2021年；Van de Waal等人，2013年；López-Rosales等人，2014年）。此外，海洋环境中溶解的MATs浓度通常相对较低（pg/L至ng/L），因此在分析前需要对其进行预处理，而预处理过程通常占总分析工作流程的70%–90%。为了保护海洋环境并迅速评估MATs的生态风险及其对人类健康的影响，必须同时满足两个关键要求：（1）快速富集和定量不同极性的毒素；（2）在大范围内开展相关研究。对沿海地区溶解的MATs进行大规模调查，使研究人员能够评估不同区域的污染水平，为食品安全风险评估和制定有效的海洋环境管理策略提供基础。最近的研究调查了全球各地区MATs的分布特征（Pierce等人，2005年；Kim等人，2023年；Costa等人，2010年；MacKenzie等人，2011年），为保护海洋生态系统和人类健康奠定了基础。随着分析技术的进步，新的有毒藻类物种逐渐被鉴定出来（Kim等人，2022年）。然而，MATs容易受到阳光和活性氧等环境因素的降解和转化（Pan等人，2020年；Li等人，2024年），这限制了现有方法快速捕捉大规模沿海海水中多种MATs的分布模式以及在低浓度下识别新出现MATs的能力。此外，MATs的低浓度和显著的极性差异给它们的同时高效富集带来了重大挑战。
固相萃取（SPE）与液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）结合是一种有效的分析 and 鉴定MATs 的方法（He等人，2020年；Pan等人，2023年）。2018年，Riccardi等人（2018年）使用Bond Elut LRC-C18和Carbograph4柱子，在1 mL/min的流速下从50 mL海水中成功富集了4种LMATs和14种HMATs。这种方法为同时富集具有显著极性差异的多种MATs提供了基础。然而，SPE柱子的富集体积小且加载速度慢，通常分别为约200 mL/min和1 mL/min（Wu等人，2019年）。这些限制阻碍了低浓度下新出现MATs的检测，并阻碍了对大规模沿海地区MATs分布的及时评估。SPE盘可以更快地富集大体积的海水样本，其富集体积和速度可以达到2 L/min和100 mL/min。2017年，Twiner等人（2007年）使用C18 SPE盘从50 mL培养基中富集了brevetoxin-3（BTX3），富集速率为50 mL/min。此外，2019年，Wang等人（2019年）使用SDB-RPS SPE盘从2 L海水中富集了domoic acid，富集速率为6 mL/min，回收率为89.3%。这些方法为海水中的MATs快速检测提供了有价值的参考。然而，现有的富集方法难以快速富集具有显著极性差异的海水中的多种MATs，也不利于识别新出现的MATs。为了实现海水中的多种具有显著极性差异的MATs的快速富集和新出现MATs的识别，关键在于选择合适的SPE盘和富集条件。
本研究旨在（1）开发一种快速富集海水中有显著极性差异的多种MATs的方法；（2）使用该方法识别新出现的MATs；（3）将该方法应用于真实海水样本，探索其作为表征大规模沿海环境中多种MATs分布的技术方法的潜力。
化学试剂和材料
HPLC级甲醇和乙腈购自Merck（德国达姆施塔特）。超纯水使用Milli-Q水纯化系统（Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德）进行纯化。LC–MS级甲酸购自Macklin（中国上海）。甲酸铵和乙酸铵购自Fluka（瑞士布克斯）。认证的标准溶液包括gymnodimine（GYM）、13-desmethyl spirolide C（SPX1）、pectenotoxin-2（PTX2）等。
具有显著极性差异的多种MATs的快速富集
适当的预处理条件对于检测海水中的多种溶解MATs和识别低浓度下的新出现MATs至关重要。由于目标LMATs（对数Kow：2.3–5.1）和目标HMATs（对数Kow：-3.8至-7.2）之间的极性差异显著，选择合适的SPE盘对于它们的有效富集至关重要。由于目标LMATs是疏水性的，应根据“相似相溶”原则选择疏水性填料。C18、SDB-XC等。
结论
我们的研究结果表明，所建立的方法可以快速分析海水中具有显著极性差异的35种溶解MATs。该方法为及时了解大规模沿海海水中的MAT污染动态提供了潜在的技术支持，并有助于保护和可持续发展区域和全球海洋环境。19-epi-OA和19-epi-DTX1在中国首次被鉴定出来，直接证明了其风险。
CRediT作者贡献声明
Jiuming Wang：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理。Bin Xu：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、研究、概念化。Wei You：研究。Jia Chen：方法学。Hua Xu：方法学。Jinjuan Xue：方法学。Yaxian Zhu：监督、项目管理、资金获取。Jianwei Xie：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、概念化。Yong Zhang：撰写——
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：22476165、21627814和22276154）的支持。
