《Microchemical Journal》：Authentication and traceability of Amazonian stingray meat via low field 1H NMR metabolic fingerprinting and chemometrics
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提高电鳐肉品真伪鉴定与溯源能力，本研究创新性地将低场1H NMR结合PCA、PLS-DA和DD-SIMCA化学计量工具，通过分析帕拉特里贡（P. aiereba）、波塔莫特里贡（P. motoro和P. orbignyi）三种野生及市场样本的代谢特征，成功区分野源与商业来源（PLS-DA准确率100%）及地理溯源（>98.5%），并鉴定出乳酸、肌酸和牛磺酸为关键生物标志物。首次验证低场NMR在濒危物种（P. aiereba）非法贸易检测中的可行性，为食品安全与生物多样性保护提供新方法。
萨尔曼·特哈里（Salman Tehari）|杰尔米尔·克拉维罗·德安德拉德（Jelmir Craveiro de Andrade）|阿德里亚诺·特谢拉·德奥利维拉（Adriano Teixeira de Oliveira）|玛丽亚·费尔南达·达席尔瓦·戈麦斯（Maria Fernanda da Silva Gomes）|凯德玛·克里斯蒂娜·山本（Kedma Cristine Yamamoto）|卡洛斯·亚当·孔特-朱尼奥尔（Carlos Adam Conte-Junior）
食品分析中心（NAL），技术发展支持实验室（LADETEC），里约热内卢联邦大学（UFRJ），大学城，里约热内卢，RJ 21941-598，巴西
摘要
全球范围内，黄貂鱼肉的消费量有所增加，这主要是由于对可持续蛋白质和异国食品的需求增加所致。然而，由于缺乏质量控制措施来验证物种身份，导致欺诈和过度开发现象频发。为了解决这一问题，我们提出了一种新的分子指纹识别方法，该方法结合了低场（LF）1H核磁共振（NMR）光谱技术与化学计量学工具（主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和数据驱动的软独立建模分类（DD-SIMCA）。本研究通过将LF 1H NMR与化学计量技术相结合，为分析化学领域做出了贡献。我们分析了三种黄貂鱼（Paratrygon aiereba、Potamotrygon motoro、Potamotrygon orbignyi）的肌肉提取物，这些样本仅被标记为Potamotrygon属。PCA结果显示，野生样本与市场样本之间存在显著的代谢差异，并且地理位置相近的种群也表现出聚集现象。PLS-DA在区分商业来源与野生来源时准确率达到100%，在确定地理来源时准确率超过98.5%。乳酸、肌酸和牛磺酸被确定为关键生物标志物。针对P. aiereba校准的DD-SIMCA显示出100%的灵敏度，能够准确排除非目标物种。一些市场样本被错误地归类为P. aiereba，这表明存在非法交易行为。这种快速且易于实施的方法提高了食品的真实性、保护水平以及供应链的透明度，同时推动了LF 1H NMR在分析应用中的发展。
引言
近年来，淡水黄貂鱼肉的消费量显著增长，这既得益于对替代蛋白质来源需求的增加，也因为人们认识到其高营养价值[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。研究表明，这种鱼肉每100克含有18–20克高生物价值的蛋白质，并且含有均衡的必需氨基酸。此外，其中还富含多不饱和脂肪酸，尤其是欧米伽-3和欧米伽-6脂肪酸，这些脂肪酸与降低心血管风险和增强免疫系统功能有关[6]、[7]、[8]。然而，过度捕捞（有时甚至是无节制的捕捞），加上不规范的商业化行为以及频繁的物种误识别，破坏了野生种群的遗传完整性，直接威胁到了水生生物多样性的保护工作[9]。
这种经济利益促使几种亚马逊地区的黄貂鱼被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录III，从而要求在生产链的各个阶段实施更严格的许可和监管[10]。例如，Paratrygon aiereba由于繁殖率低和栖息地丧失，最近被列为极度濒危物种，但它仍然遭到非法捕捞和交易，常常被错误地标记为其他允许交易的物种，从而削弱了保护工作[11]。
为了防止商业欺诈和保护脆弱种群，分析化学发挥着重要作用，因为它能够应用严格而精确的技术进行物种鉴定和地理溯源[12]、[13]。在物种监测和食品安全保障方面，最成熟的技术包括使用DNA条形码进行分子鉴定（具有很高的分类精度[14]），以及碳（δ13C）和氮（δ15N）的稳定同位素分析（能够绘制出营养生态位和捕捞区域的“化学地图”[15]）。同时，快速且非破坏性的光谱方法（如可见光/近红外（VIS/NIR）、中红外/傅里叶变换红外（MIR/FTIR）和拉曼光谱）在海鲜的鉴定、溯源方面得到了广泛应用，当与化学计量学结合使用时表现出良好的操作稳健性[16]。然而，在水分含量高的新鲜样品中，水相关谱带通常会占据光谱的大部分，这可能会降低化学选择性，需要额外的预处理和校准策略来保持分析性能[16]。虽然之前使用射频核磁共振（RF-NMR）对鱼类和海鲜的研究取得了优异成果，但这些方法仅限于评估质量和加工效果，无法用于物种鉴定或溯源[17]、[18]。
尽管取得了总体进展，但专门针对亚马逊地区黄貂鱼肉鉴定和溯源的研究仍然较少；在之前的研究中，我们团队基于肉的颜色提出了一种监测策略[13]、[19]，该策略表明有些样本可能存在非法交易行为，从而强调了快速方法在执法支持中的重要性。然而，作为一种物理标记，这种策略需要进一步基于化学/分子特征进行研究，以提供更可靠的物种身份和来源信息[16]。
尽管这些方法在鱼类产品的鉴定和溯源中仍占据核心地位，但人们越来越关注开发能够更快、更经济地提升检测能力的互补分析方法。在这种情况下，低场核磁共振（LF-NMR）光谱技术成为了一个有前景的替代方案。这种技术利用原子核与磁场的相互作用，具有便携性好、采集成本低、操作简便等优点，对于固体样品几乎不需要任何预处理，而液体样品则完全不需要处理[20]。在分析应用中，LF-NMR能够快速获取代谢谱图，提供样品中化合物的总体信息。这些特点使得LF-NMR特别适合常规检测应用，尤其是在实验室基础设施有限或现场操作的情况下。因此，LF-NMR作为一种战略性的补充工具，有潜力加强渔业领域的控制、溯源和鉴定工作[21]、[22]、[23]。
尽管LF-NMR在食品工业中的应用仍不广泛，但先前的研究已经证明了其在评估鱼类和海鲜质量变化方面的有效性。值得注意的是，LF-NMR主要应用于弛豫测量技术，通过分析弛豫参数（T1和T2）来评估不同冷冻方法对产品质量的影响[24]、[25]。此外，该技术还展示了在优化虾类及其他肌肉类食品加工方面的应用价值，例如评估多磷酸盐、预浸时间和冷冻对虾肌肉特性的影响[26]。LF-NMR还被用于评估三聚磷酸钠对冷冻虾的影响，以及根据肌肉特性和冷冻方法区分养殖鳕鱼与野生鳕鱼[27]。此外，结合磁共振成像（MRI）的研究还监测了盐水环境中卵细胞质子的变化以及杂交鲟鱼鱼子酱的质量，证明了其在高价值食品质量监测中的潜力[28]。
LF-NMR也存在一些局限性，例如相对于高场核磁共振（HF-NMR）光谱仪，其灵敏度较低，且光谱重叠现象更严重。这些限制可能会影响准确信息的提取，尤其是在复杂样品中[29]、[30]。为了克服这些限制并从光谱中提取最大信息，化学计量学工具至关重要。主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和基于独立建模的分类（SIMCA）等方法在代谢组学研究中已被证明有效[31]、[32]、[33]。特别是PLS-DA在溯源任务中表现出色，而SIMCA则更适合产品鉴定，例如区分不同物种[34]、[35]。最近，单类方法（如DD-SIMCA）也受到了关注，因为它们能够构建仅描述目标类别（如濒危物种）的稳健模型，并评估新样本与该类别的相关性[36]、[37]。
本研究提出了一种创新的亚马逊地区黄貂鱼肉鉴定和溯源方法，首次展示了LF 1H NMR在这些物种肌肉组织中的适用性。我们分析了三种淡水黄貂鱼：Paratrygon aiereba、Potamotrygon motoro和Potamotrygon orbignyi，样本来自巴西亚马孙州不同地区的自然环境和市场。研究的重点是利用代谢指纹和监督学习及无监督的化学计量学工具，识别每种物种的独特分子特征及其商业和地理来源。主要目标是：（i）追踪肉的地理和商业来源（野生与商业来源）；（ii）按物种对样本进行鉴定，特别是针对濒危物种P. aiereba。这项工作代表了分析化学领域的重大进展，证明了尚未得到充分开发的LF NMR技术如何应用于食品安全、环境监测和物种保护的实际解决方案。所提出的方法提供了一种稳健且可扩展的替代方案，有助于打击供应链中的欺诈行为，支持渔业管理，并基于可靠的分析数据加强保护策略。
地区和数据集概述
生物材料的采集和处理程序已获得奇科·门德斯生物多样性保护研究所（ICMBIO）的批准（授权编号76.127–4和87,051–1），以及亚马孙联邦教育科技研究所（IFAM）和亚马孙联邦大学（UFAM）的动物使用伦理委员会（CEUA）的批准（授权编号23105.050011/2024–43和1955.0905/2023）。
LF-1H NMR化学谱图
图2所示的LF-1H NMR谱图详细揭示了黄貂鱼肉的代谢特征，包括商业来源样本与地理来源样本之间的差异以及物种间的差异。需要注意的是，LF NMR具有固有的光谱分辨率限制，这可能会影响代谢物鉴定的准确性，尤其是在结构相似化合物的信号重叠时[52]。这些限制在...
结论
本研究表明，LF-1H NMR代谢指纹识别结合多变量分类器和单类建模可以有效追踪（商业和地理来源）并鉴定（物种）亚马逊地区的淡水黄貂鱼肉。探索性PCA一致地发现了数据中的结构化模式，例如市场采购的样本表现出与野生捕获样本不同的代谢谱型，而地理位置相近的种群也表现出...
CRediT作者贡献声明
萨尔曼·特哈里（Salman Tehari）：撰写初稿、软件开发、方法设计、研究实施、资金申请、数据分析、数据管理、概念构建。
杰尔米尔·克拉维罗·德安德拉德（Jelmir Craveiro de Andrade）：验证结果、监督工作、资源协调、项目管理、方法设计、研究实施、数据分析、数据管理、撰写及审稿编辑。
阿德里亚诺·特谢拉·德奥利维拉（Adriano Teixeira de Oliveira）：撰写及审稿编辑、数据可视化、监督工作、研究实施、数据分析。
玛丽亚·费尔南达·达席尔瓦·戈麦斯（Maria Fernanda da Silva Gomes）：撰写...
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢IQ-UFRJ的环境与生物分析化学实验室（LAABBM）的支持。本研究得到了巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）的资助（项目编号[307846/2020-2]和[213129/2020-1），以及里约热内卢州研究基金会（FAPERJ）的资助（项目编号[E-26/201.534/2022]和[E-26/200.738/2023]。部分资金还来自...
