《Talanta》：Online Supercritical Fluid Derivative Extraction-Pressure Change Focusing-Supercritical Fluid Chromatography-Mass Spectrometry for Identification of Double Bond Positional Isomers in Unsaturated Lipids
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在线超临界流体衍生化-压力变化聚焦-超临界流体色谱-质谱联用技术实现脂质快速分析，显著提升双键定位灵敏度，在精神分裂症模型血浆中发现8种显著变化的脂肪酸异构体，为代谢调控研究提供新方法。
黄龙辉|吴再新|刘佳琪|余殿宝|周婷
华南理工大学生物与生物工程学院，广州，510006，中国
摘要
在不饱和脂质中精确定位碳-碳双键对于阐明脂质功能和疾病机制至关重要，然而传统的液相色谱-质谱工作流程受到劳动密集型预处理、溶剂消耗和灵敏度不足的制约。在这里，我们提出了一个在线超临界流体衍生化提取-压力变化聚焦-超临界流体色谱-质谱平台，将衍生化、提取、纯化、分离和检测集成到单一自动化工作流程中。超临界流体衍生化提取策略实现了原位环氧化和净化同时进行，而压力变化聚焦策略有效减轻了色谱峰宽化，获得了更尖锐的峰形并提高了灵敏度。通过系统优化，建立了稳定的操作条件，仅需2.5 μL样品即可完成全面的脂质分析，整个过程仅需24分钟。验证后的方法表现出优异的线性、准确性和回收率，决定系数（R2）>0.9930，回收率为73.8-111.8%，准确率为82.1-116.4%，精密度优于13.7%（RSD）。该方法应用于精神分裂症小鼠模型的血浆样本，共鉴定出56种不饱和脂肪酸，并确定了其碳-碳双键的精确位置，其中8种物种的丰度发生了显著变化。此外，异构体比例分析揭示了与疾病相关的饱和度模式的重塑，为精神分裂症中的脂质代谢失调提供了新的见解。总体而言，所建立的在线平台是一种快速、灵敏且环保的结构脂质组学策略，在生物标志物发现和生物医学及临床研究中有广阔的应用前景。
引言
脂质在多种生物过程中发挥着重要作用，其合成或代谢异常与许多疾病有关，包括心血管疾病[1]、癌症[2]和阿尔茨海默病[3]。不饱和脂质可占生物体内总脂质含量的80%，碳-碳双键（C=C）的存在显著影响其结构和功能特性[4]。因此，对不饱和脂质的定性和定量分析——特别是对C=C键的精确定位——对于理解脂质功能、识别疾病生物标志物和开发新疗法至关重要。这仍然是生物分析科学中的一个关键且活跃的研究领域。
目前，液相色谱-质谱（LC-MS）是脂质分析中最常用的技术之一[5]。然而，不饱和脂质异构体的准确鉴定和定量仍面临重大挑战。这些异构体通常具有相似的物理化学性质，使得色谱分离变得困难。此外，传统的低能量碰撞诱导解离（CID）无法断裂C=C键，也无法生成用于定位双键的诊断离子[6]。化学衍生化结合质谱已成为C=C键定位的主流方法，包括臭氧解[7]、环氧化[8]、氮杂环丙烷化[9]和Paternò-Büchi反应[10]。尽管这些方法有效，但通常需要复杂的样品预处理——尤其是对于血浆等生物基质——这增加了样品损失和基质干扰的风险[11]。此外，衍生化和LC-MS工作流程通常涉及大量有机溶剂，与绿色化学的原则相悖[12]。因此，开发绿色、高效且高灵敏度的不饱和脂质分析技术是生物分析化学中的迫切需求和重点。
由于其独特的物理化学性质[13]，超临界流体在分析科学中引起了越来越多的关注。其中，二氧化碳应用最为广泛，因为它具有温和的临界条件、低成本和环保性，以及易于分离的特点。超临界CO2广泛应用于超临界流体反应（SFR）[14]、超临界流体提取（SFE）[15]和超临界流体色谱（SFC）[13]。与传统技术相比，SFE减少了有机溶剂的消耗并简化了产物回收过程，而SFC由于流动相的低粘度和高扩散性，提供了快速分析、低背压和高分离效率。SFE和SFC的在线耦合（SFE-SFC）结合了两种技术的优势，提供了一种简单、省时且环保的方法[16]。它已成功应用于天然产物、制药、生物化学、食品安全和环境科学等领域[16]。然而，现有的基于超临界流体的集成系统仍面临一些技术挑战：（i）大体积提取物的直接注入往往会导致溶剂过载，从而引起色谱峰宽化和失真。为了解决这个问题，通常采用分流技术，但这不可避免地会导致样品损失以及灵敏度和重复性的降低[17]；（ii）与液-液提取后进行SFC的离线方法相比，分析复杂生物样本时基质效应更为明显[18]。因此，建立一个绿色、高效且灵敏的集成平台，实现衍生化、纯化、分离和检测的集成，仍是超临界流体脂质组学发展的关键瓶颈。
为了解决这些挑战，我们开发了一个在线超临界流体衍生化提取-压力变化聚焦-超临界流体色谱-质谱（SFDE-PCF-SFC-MS）系统。在该系统中，血浆样本中的不饱和脂质的衍生化、提取和纯化均在超临界条件下进行。采用压力变化聚焦（PCF）策略将分析物集中在色谱柱头部，实现了全体积注入并显著提高了检测灵敏度。值得注意的是，PCF概念与我们之前报道的策略一致[19]，并在本工作中将其集成到基于SFDE的“一锅法”工作流程中，以解决全体积在线转移引起的峰宽化问题。从衍生化到提取、净化、分离和检测的整个工作流程仅需20分钟，仅需2.5 μL样品，为痕量分析提供了绿色高效的解决方案。最后，该平台应用于精神分裂症小鼠模型的血浆样本中不饱和脂质的定性和定量分析，展示了其在疾病相关脂质组学和生物标志物发现中的潜在应用。
材料与试剂
本研究使用了九种脂质标准品：FA 14:1 (9Z)、FA 16:1 (9Z)、FA 17:1 (10Z)、FA 18:1 (9Z)、FA 18:1 (11Z)、FA 18:2 (9Z,12Z)、FA 18:3 (6Z,9Z,12Z)、FA 18:3 (9Z,12Z,15Z) 和 FA 20:4 (5Z,8Z,11Z,14Z)，以及一种内标（IS），d17-FA 18:1 (9Z)。所有脂质标准品和内标均购自Cayman Chemical（美国密歇根州安娜堡）。meta-氯过氧苯甲酸（m-CPBA，纯度≥77%）购自Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd.（中国上海）。使用了四种吸附剂——钛
在线SFDE-PCF-SFC-MS的实现
开发的在线SFDE-PCF-SFC-MS平台将四个功能模块集成到一个连续的工作流程中：超临界流体衍生化提取（SFDE）、压力变化聚焦（PCF）、柱内聚焦样品加载和质谱检测（图1）。该设计使得复杂的衍生化、提取、净化、分离和检测可以在一个系统中无缝完成。
在SFDE的第一步中，血浆样本和衍生化
结论
在这项研究中，我们开发了一个在线SFDE-PCF-SFC-MS平台，将衍生化、提取、纯化、分离和检测集成到单一自动化工作流程中。该方法利用SFDE实现高效的原位环氧化和净化，并采用PCF策略提高色谱分辨率和检测灵敏度。通过来自环氧化产物的诊断碎片离子定位了C=C键的位置。对复杂生物样本的整个脂质分析
CRediT作者贡献声明
周婷：写作——审稿与编辑、监督、软件、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念化。余殿宝：软件、方法学。刘佳琪：软件、方法学。吴再新：写作——初稿撰写、可视化、研究、数据分析、数据管理。黄龙辉：可视化、验证、方法学、研究、数据分析
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：22374051）和广州应用基础研究计划（编号：202201010109）的支持。
