《Talanta》：Label-Free Raman Chemometric Analysis for In Situ Authentication and Molecular Profiling of Wagyu Beef under Retail Packaging
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和牛通过拉曼光谱与PLS-DA化学计量学方法实现非破坏性鉴别，并利用SVD-NMF分解和NNLS回归揭示了不饱和甘油三酯的分子差异，建立零售包装条件下高效准确的认证体系。
Jia-En Kao|Chang-Chun Li|Ming-Syue Lin|Kohei Yokosawa|Takakazu Nakabayashi|Tai-Sheng Yeh|Ian Liau
雅德荣誉计划，国立阳明交通大学文理学院，大学路1001号，新竹30010，台湾
摘要
和牛牛肉独特的风味和嫩度源于其肌肉中不饱和甘油三酯的高含量。尽管这些成分特征提供了独特的拉曼光谱特征，但由于光谱带的重叠以及包装和冷冻条件导致的背景衰减，使得现场分类变得困难，并限制了原始光谱的可解释性。本研究提出了一种无标记的拉曼光谱和化学计量方法，用于在类似零售的真实条件下鉴定和牛牛肉。我们使用未包装的脂肪组织光谱开发了一个监督式偏最小二乘判别分析（PLS–DA）模型，并用来自多个品种和供应商的冷冻、塑料包装样品的独立验证集进行了评估。该模型在样本层面实现了100%的分类准确率，这一结果得到了接收者操作特征分析和混淆矩阵分析的支持。为阐明区分机制的分子基础并解决光谱重叠问题，我们应用了结合奇异值分解（SVD）和非负矩阵分解（NMF）的两阶段分解方法，随后使用纯甘油三酯标准进行了非负最小二乘（NNLS）拟合。分析结果揭示了和牛牛肉中不饱和甘油三酯的富集，这与已知的成分数据一致。据我们所知，这是首次将基于拉曼的PLS–DA方法应用于和牛牛肉鉴定，并结合SVD、NMF和NNLS进行分子水平解释的研究。总体而言，拉曼光谱结合可解释的光谱分解为肉类鉴定和质量保证提供了一种快速、无损且化学透明的工具。
引言
牛肉和其他肉类产品是高质量蛋白质、必需脂肪酸、维生素和生物活性化合物的重要来源，对人类健康和营养至关重要[1]。牛肉的物理化学和感官特性，如嫩度、多汁性、风味和营养价值，受到遗传背景、饲养方式、饲养实践和死后处理等多种因素的影响[2]、[3]。在优质牛肉品种中，和牛因其独特的大理石纹而脱颖而出，这种大理石纹由细小的肌肉内脂肪组成，分布在肌肉纤维中。这种常被描述为“雪花状”的独特纹路是日本和牛生产系统的标志，该系统强调通过遗传选择、饲养实践和长期育肥来优化肉质[4]。除了外观吸引力外，和牛牛肉还因其独特的脂质组成以及在烹饪过程中产生的特定挥发性化合物而具有独特的气味和风味[5]、[6]。这些结构和成分特征共同造就了和牛牛肉丰富的黄油风味、极高的嫩度以及其在全球市场上极高的价值。
由于和牛牛肉价格昂贵、供应有限且消费者需求旺盛，它特别容易受到经济驱动的食品欺诈行为的影响，包括被替换或错误标注为低等级牛肉[7]。这些行为不仅损害了消费者的信任，还导致了经济损失并降低了供应链的透明度[8]。因此，迫切需要开发出成本效益高、无损的分析方法，以便在零售环境中现场鉴定和牛牛肉。可靠的验证工具对于确保产品真实性、支持透明供应链以及保护消费者免受误导至关重要[9]。
已经采用了多种分析技术来评估肉制品的真实性，每种技术都有其独特的优势和局限性。基于蛋白质组学的方法，包括质谱和肽谱分析，在物种和品种鉴定方面表现出高特异性[10]、[11]，而稳定同位素比值分析则用于追踪地理来源和饲养方式[12]、[13]。然而，基于组学的方法通常需要复杂的样品准备、昂贵的仪器以及专业操作，这限制了它们在常规或现场鉴定中的可行性。
光谱方法，特别是近红外（NIR）和傅里叶变换红外（FTIR）光谱，因其快速、无损的特点而受到关注[14]、[15]。NIR光谱提供了“即插即用”的分析方式，对样品处理要求较低，但存在宽泛且重叠的吸收带，限制了化学特异性[16]。FTIR光谱通过特征振动信号提供了更丰富的结构信息，但其应用于完整肉样本时受到强水吸收的影响，并且需要直接接触样品或特定的传输几何结构[17]、[18]。
相比之下，拉曼光谱具有高化学特异性，受水干扰小，并能够以无损的方式检测出细微的成分差异[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。最近的研究成功地将拉曼光谱与化学计量算法（如主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS–DA）结合使用，根据生产系统、品种或脂质组成区分肉样[26]、[27]、[28]。多变量分析的进步进一步提高了光谱的可解释性[29]。特别是，非负矩阵分解（NMF）和非负最小二乘（NNLS）使得复杂拉曼光谱能够分解为具有化学意义的成分，避免了传统PCA或线性回归产生的物理上不可解释的负载荷[30]、[31]。
鉴于这些优势，拉曼光谱为在类似零售的真实条件下无损、无标记地鉴定和牛牛肉提供了一个有前景且多功能的平台。然而，虽然之前的研究已经证明了拉曼光谱在一般肉类分类中的可行性，但很少有研究在实际包装和冷冻条件下严格应用它来鉴定和牛牛肉，或者将其与能够提取分子水平生化信息的先进化学计量方法结合使用。本研究通过将拉曼光谱与一系列化学计量分析相结合，解决了这些不足，既识别了和牛牛肉，又阐明了其潜在的分子和成分特征。
本研究的主要目标是：（1）利用拉曼光谱开发一种快速、无损的方法，在实际零售条件下鉴定和牛牛肉；（2）通过分子分析其甘油三酯组成，阐明和牛牛肉与普通牛肉之间的生化差异。为了实现这些目标，我们实施了一个多层次的分析框架：使用PLS–DA进行稳健的分类，使用SVD–NMF解决潜在的光谱结构，使用NNLS回归将分解后的成分与纯甘油三酯标准进行定量关联。据我们所知，这是首次将基于拉曼的PLS-DA应用于和牛牛肉鉴定，也是首次将SVD–NMF与NNLS结合用于食品鉴定中的化学可解释的分子水平光谱分解。
部分内容摘录
材料与方法
样品选择。模型构建的数据集包括四种类型的牛肉，分别代表和牛和非和牛类别：来自鹿儿岛的日本谷物饲养和牛（Wagyu）、澳大利亚谷物饲养和牛（Wagyu）、美国谷物饲养的Prime Angus（非Wagyu）以及新西兰草饲牛肉（非Wagyu）。
为了评估模型的泛化能力，还分析了一个包含八个额外牛肉样本的独立外部验证集。这些样本来自不同的供应商、品种或个体牛只。
结果与讨论
肌肉内脂肪的拉曼光谱分析。 图1展示了从和牛和非和牛牛肉样本的肌肉内脂肪中获得的拉曼光谱的比较分析。粗曲线代表每组的平均光谱，而阴影区域表示每组50个独立光谱的标准偏差。两组都表现出典型的与脂质相关的拉曼特征，主要由甘油三酯振动带主导。
关键振动带已标注。
结论
本研究通过将拉曼光谱与先进的化学计量建模相结合，建立了一个快速、无损且化学可解释的框架，用于鉴定和牛牛肉。通过结合监督分类（PLS–DA）与无监督和半定量分解（SVD–NMF和NNLS），我们实现了完美的样本级别分类准确性和对区分和牛牛肉与非和牛牛肉的脂质组成的分子水平洞察。
CRediT作者贡献声明
Jia-En Kao：撰写——原始草稿、方法论、研究、正式分析、数据管理。Takakazu Nakabayashi：撰写——审阅与编辑、概念化。Tai-Sheng Yeh：撰写——审阅与编辑、方法论、研究、正式分析、概念化。Ian Liau：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、方法论、研究、概念化。Chang-Chun Li：撰写——原始草稿、方法论、研究、正式分析、数据管理。Ming-Syue Lin：
数据声明
支持本研究发现的数据和代码可向相应作者索取，用于合法的学术或研究目的。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本手稿中的工作。
致谢
I.L. 感谢台湾的国家科学技术委员会（NSTC）提供的资助（NSTC 114-2113-M-A49-028 和 111-2113-M-A49-020-MY3）。这项工作还得到了台湾阳明交通大学新兴功能物质科学中心的支持，该中心属于教育部（MOE）高等教育萌芽项目下的特色领域研究中心计划。
