《Forensic Science International》：An Isothermal Amplification-Based Field On-site Rapid Test for Direct Detection of Male DNA via the Y-Specific TSPY4 Gene
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基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术开发了快速检测男性DNA的FORT-TSPY方法，目标基因为Y染色体特异性TSPY4。通过引物步行策略优化引物对，确定最佳浓度（非高或低即好），灵敏度达1.2×101 copies（10?11 ng），特异性检测男性DNA，无女性或非人DNA交叉反应。模拟现场测试验证其可行性，为便携式分子检测提供新方案。
雷友|张俊梅|李志伟|王晓青|韩明阳|钟璐瑶|史贤明|吕俊|赵俊宏|陈莉|李彤|郑兰兰|张永红
中国湖北省医学科学院基础医学院泰和医院胚胎干细胞研究重点实验室，十堰442000
摘要
重组酶聚合酶扩增（RPA）是一种快速、便携且适用于等温条件下的DNA检测方法，在法医学应用中具有巨大潜力。在本研究中，我们开发并优化了一种针对Y染色体特异性基因TSPY4的RPA检测方法，称为FORT-TSPY（现场快速检测），用于快速直接检测男性DNA。通过多轮筛选使用引物 walks策略，我们确定了最佳的引物对。通过男性DNA样本确定了高效扩增所需的最佳引物浓度，结果表明引物浓度并非简单的高低优劣问题，而是存在一个最佳浓度范围。该检测方法表现出极高的灵敏度，能够在30分钟内检测到低至1.2 × 10^1拷贝（约10^-11 ng）的质粒DNA，且无需复杂的实验室设备。此外，该方法对男性DNA具有高度特异性，未观察到与女性或非人类DNA的交叉反应。在模拟的法医条件下进行的随机测试表明，该检测方法具有在现场进行男性DNA检测的潜力。综上所述，基于RPA的FORT-TSPY为实验室PCR工作流程提供了一种快速、依赖设备较少的替代方案或补充方法，进一步展示了FORT现场快速检测平台在证据点核酸检测中的广泛适用性。
引言
法医核酸检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、短串联重复序列（STR）分析和DNA条形码技术，已经达到了很高的成熟度[1]。其中，PCR和多重PCR常用于从有机痕迹中确定人类性别[2]。然而，基于PCR的方法受到对复杂热循环设备依赖、高能耗以及需要精密实验室设施和熟练人员的限制。这些限制阻碍了它们在资源有限的环境或小型非专业实验室中的应用，尤其是在现场和实时检测需求方面。这些局限性增加了人们对便携式、设备要求低的分子平台的兴趣。基于等温扩增技术的进步，我们正在开发现场快速检测（FORT）平台，该平台将重组酶聚合酶扩增（RPA）技术应用于低温、快速的核酸检测，直接在证据收集点进行。
等温核酸扩增技术，包括环介导的等温扩增（LAMP）[3]、重组酶聚合酶扩增（RPA）[4]和基于核酸序列的扩增（NASBA）[5]，因其简单性、快速反应时间和低设备要求而受到关注。例如，LAMP使用特异性引物在等温条件下扩增DNA，显示出适用于法医应用中的微量DNA检测的高灵敏度。在这些技术中，RPA因其能够在低温下扩增DNA、快速反应时间、设备独立性和引物设计简便性而脱颖而出。RPA已广泛应用于食品科学[6]、医学诊断[8]和环境研究[9]等多个领域。尽管其在法医学中的应用仍处于发展阶段，但RPA在需要快速可靠DNA检测的现场和紧急法医分析中具有巨大潜力。
RPA已成功与多种检测方式结合使用，尤其是实时荧光检测和侧向流动条（LFS）。在实时RPA中，使用含有四氢呋喃（THF）修饰的Exo探针[10]。与目标链杂交后，外切酶会切割THF位点，释放3'端以进行延伸，并将荧光团与其淬灭剂分离，从而产生信号[11]，[12]。这种方法可以实现连续监测，同时兼顾了速度、便携性和易用性的理想平衡[11]。或者，RPA可以与LFS结合用于可视化检测。在这种格式中，RPA产物被双标记（通常使用FITC和生物素），并通过金纳米颗粒捕获，无需特殊设备即可肉眼解读结果[13]。
在法医学背景下，通过Y染色体分析检测男性特异性DNA对于亲子鉴定、刑事调查和基因身份确认等应用至关重要[2]。[2]关键的男性DNA序列位于人类Y染色体上，包括SRY基因（性别决定区域Y；Yp11.2）、DYS系列短串联重复序列（Y-STRs）、AZF基因（无精因子）、Amelogenin Y等位基因[15]、MEL1（线粒体内源性位点1）和TSPY（睾丸特异性蛋白Y；Yp11.2）。先前的研究已经探讨了针对Y染色体着丝粒区域重复序列的RPA引物，如alfoid重复序列（GenBank登录号：AF522078；Yq74）[16]。然而，这些序列缺乏典型的法医特征，设计的引物特异性较差，限制了其实际应用。最近开发的针对SRY基因的RPA检测方法在精液样本中显示出高灵敏度[17]。然而，SRY是一个单拷贝基因，这可能会限制检测灵敏度，尤其是在微量或降解的DNA样本中[18]，[19]。相比之下，位于Y染色体长臂（Yq11.2）的TSPY4基因具有明显优势。TSPY4属于一个高度保守的多拷贝基因家族，仅存在于Y染色体上，并主要在睾丸中表达，参与精子发生过程。TSPY4的多拷贝特性和Y染色体特异性提高了检测灵敏度，同时保持了高特异性，使其成为法医应用中检测男性特异性DNA的可靠分子标记[19]。
在本研究中，我们开发并优化了一种针对Y染色体特异性基因TSPY4的RPA检测方法，称为FORT-TSPY（现场快速检测），用于快速直接检测男性DNA。通过多轮筛选使用引物 walks策略确定了最佳的引物对。通过男性DNA样本确定了高效扩增所需的最佳引物浓度，表明引物浓度并非简单的高低优劣问题，而是存在一个最佳浓度范围。该检测方法表现出极高的灵敏度，能够在30分钟内检测到低至1.2 × 10^1拷贝（约10^-11 ng）的质粒DNA，且无需复杂的实验室设备。此外，该方法对男性DNA具有高度特异性，未观察到与女性或非人类DNA的交叉反应。在模拟的法医条件下的性能评估证实了其在现场法医分析中的潜力。综上所述，FORT-TSPY为实验室PCR工作流程提供了一种快速、依赖设备较少的替代方案或补充方法，进一步展示了FORT平台在证据点核酸检测中的广泛适用性。
样本收集与准备
标准的人类（男性和女性）以及各种雄性动物（狗、猫、猪、马、牛和小鼠）DNA由武汉当康兴中生物科技有限公司提供。所有样本（血液、精液、唾液）均来自湖北医药大学附属泰和医院的医学检测部门。参与者信息被保密，仅保留性别信息。所有参与者均签署了书面知情同意书。
候选扩增引物的初步筛选
选择位于Y染色体长臂（Yq11.2）的TSPY4基因作为检测男性特异性DNA的目标。鉴于RPA的性能很大程度上取决于引物的特异性和效率，我们开发了一个一体化的便携式检测平台，并结合了现场快速检测（FORT）工作流程（图1）。该系统能够高效评估引物性能和扩增效率，并支持实时结果分析。
讨论
检测男性DNA对于法医鉴定、亲子鉴定、刑事调查和基因研究至关重要[2]。随着技术的进步，等温扩增技术在快速、便捷和高灵敏度的现场检测方面具有巨大潜力。虽然许多等温核酸扩增方法在法医学应用中仍处于研究阶段，但基于RPA的方法，如本研究中开发的FORT-TSPY系统，
结论
本研究开发并优化了基于RPA的FORT-TSPY检测方法，针对Y染色体特异性基因TSPY4，能够在30分钟内实现高灵敏度和特异性的微量男性DNA检测，且无需复杂仪器。其在模拟现场条件下的稳定性能凸显了其在快速法医DNA分析中的潜力，并支持FORT平台在证据点核酸检测中的广泛应用。尽管TSPY4显示出巨大潜力，
参与同意书
样本已被匿名处理，未用于临床诊断。未涉及任何额外的侵入性程序或风险。湖北医科大学伦理委员会已免除书面知情同意的要求。
伦理声明
本研究已获得湖北医科大学科学技术伦理委员会的批准（批准编号：2025-RE-018）。
作者贡献声明
史贤明：验证、数据分析。
吕俊：可视化、数据分析。
韩明阳：验证、软件开发。
钟璐瑶：软件开发、实验设计。
李彤：监督、数据分析。
郑兰兰：监督、数据管理。
雷友：撰写初稿、方法设计。
赵俊宏：项目管理、方法设计。
陈莉：监督、资源协调。
李志伟：验证、数据分析。
王晓青：软件开发、数据管理。
张永红：撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
本研究得到了湖北省医学大学首席研究员计划[HBMUPI202104]和湖北省高等教育优势学科组（生物学与医学）项目（2021-2025）[2022BMXKQT4]、国家自然科学基金[32200680]、湖北省教育厅科研计划[T2023016]、湖北省青年拔尖人才培养计划的支持，以及湖北省相关部门的联合支持。
