《Microscopy and Microanalysis》：Light Sheet Fluorescent Microscopy and Automated 3D Image Analysis for Quantitative Lineage Tracing in Mouse Cornea
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本研究针对多色谱系追踪（Confetti）中组织透明化、免疫标记渗透性与荧光信号保存难以兼顾的瓶颈，建立了结合光片荧光显微镜（LSFM）成像与三维图像分析的完整技术流程。以小鼠角膜为模型，通过双视角倒置选择性平面照明显微镜（diSPIM）获取细胞级分辨率图像，开发了Prrx1表达细胞的谱系追踪方案，实现了角膜基质与内皮区细胞数量、厚度、曲率等形态计量学参数的自动测算，并引入信号泄漏校正算法精准量化克隆扩张。该研究为大型样本的定量谱系追踪提供了方法学支持，可推广至其他器官研究。
在组织再生与修复研究中，精确追踪细胞命运需要高分辨率的三维成像技术。多色谱系追踪（Confetti）技术能通过随机表达荧光蛋白标记细胞及其后代，但传统成像方法难以在大型样本中同时实现组织透明化、免疫标记渗透和荧光信号保存。光片荧光显微镜（LSFM）虽能对完整器官进行成像，却因组织透明化试剂对荧光信号的淬灭作用而受限。此外，免疫标记所需的渗透处理会进一步削弱内源荧光信号，导致多色通道间信号泄漏，影响定量准确性。
为突破这些局限，研究人员在《Microscopy and Microanalysis》发表论文，建立了一套整合LSFM成像与自动化三维图像分析的流程，并以小鼠角膜为模型开展定量谱系追踪研究。角膜因其天然透明性及密集的神经分布，成为优化信号保存与免疫标记条件的理想对象。研究聚焦于角膜基质和内皮中Prrx1（Paired-related homeobox 1）阳性细胞，利用双视角倒置选择性平面照明显微镜（diSPIM）获取全角膜三维图像，并通过自定义ImageJ脚本实现角膜分层（上皮、基质、内皮）的自动分割与细胞计数。针对Confetti荧光蛋白的信号泄漏问题，团队开发了泄漏百分比计算与校正算法，显著提升了颜色分配的准确性。进一步通过图论分析量化克隆扩张，并测试了多种渗透方案以兼容神经纤维免疫标记（PGP9.5）。
关键方法概述
研究使用Prrx1-Cre/ERT2,-EGFP与R26R-Confetti转基因小鼠，通过他莫昔芬诱导Cre重组酶激活Confetti标记。角膜样本经EZ View溶液（75%碘海醇+6M尿素）轻度透明化处理，采用diSPIM进行多通道成像。图像通过BigStitcher插件拼接，并基于甲基绿核染色进行自动分割。Confetti信号泄漏通过重组前后样本的通道强度比计算，并依此校正荧光强度。克隆扩张分析采用K近邻图模型，比较实际与随机颜色标签下的连通分量大小。免疫标记优化测试了四种渗透方案，最终确定10% DMSO+0.2% Triton-X100联合98%乙醇处理可平衡信号保存与抗体渗透。
双视角光片显微镜实现小鼠眼前段细胞级分辨率成像
通过diSPIM双视角扫描与图像配准，获得了各向同性分辨率的全角膜三维图像，清晰区分上皮、基质、内皮及相邻结构（虹膜、晶状体）。与单视角图像相比，双视图融合有效消除了边缘信号衰减，为后续定量分析奠定基础。
角膜三维图像的自动分割与形态计量学
基于核密度差异的自动分割脚本将角膜分为三层，计算得出角膜细胞总数约32.9万，上皮层占比86.7%。厚度测量显示中央上皮显著厚于周边区，而基质与内皮厚度分布均匀。曲率分析表明角膜内表面曲率低于外表面，与厚度变化一致。
Prrx1阳性细胞群定量为谱系追踪提供基础
在他莫昔芬诱导前，eGFP标记显示Prrx1表达仅限于基质（25.5%）和内皮（14.3%），上皮无信号。该分布确认了追踪靶区的可行性，且内皮区细胞比例在诱导后升高，提示增殖活性。
Confetti信号泄漏校正提升颜色分配可靠性
鉴定出hrGFPII→mCerulean（36%）、hrGFPII→mYFP（16%）和mYFP→hrGFPII（66%）三类主要泄漏，并通过线性校正消除干扰。校正后图像显示基质与内皮中Confetti阳性细胞比例分别为29.4%与34.0%，高于初始Prrx1阳性比例，进一步印证细胞扩增。
碱烧伤模型中克隆扩张量化揭示修复动态
正常角膜中Confetti颜色分布均匀，而碱烧伤21天后出现同色细胞簇。新开发的克隆扩张指标（基于KNN图连通分量大小与随机置换的差值）显示内皮克隆扩张（0.64）显著高于基质（0.36），损伤后基质指标升至0.74，证实创伤可加速克隆增殖。
免疫标记与Confetti信号共存方案的优化
对比四种渗透协议后，10% DMSO+0.2% Triton-X100联合98%乙醇处理在保留可辨识Confetti信号的同时，成功实现了上皮与基质神经纤维（PGP9.5）的免疫标记，为表型关联分析提供可能。
结论与意义
本研究首次将LSFM与Confetti谱系追踪、免疫标记整合于大型三维样本分析中，解决了透明化、信号保存与渗透性之间的平衡难题。通过自动图像分割、信号泄漏校正与克隆扩张量化算法，实现了角膜基质与内皮细胞命运的精准定量。所建立的图像处理流程（代码已开源）与渗透方案为其他器官的谱系追踪研究提供了可适配的技术框架，尤其适用于再生过程中细胞行为的三维动态解析。
