《Journal of Biological Chemistry》：Profiling the Pancreatic Cancer Secretome with Metabolic Glycoengineering
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本研究针对胰腺癌(PC)缺乏高特异性、高灵敏度生物标志物的难题，创新性地将代谢糖基化工程(MGE)与LC-MS/MS蛋白质组学技术相结合，开发了"MGE-LC-MS/MS"新策略。研究人员利用1,3,4-O-Bu3ManNAz对胰腺癌细胞分泌蛋白进行代谢标记，通过生物正交点击化学反应富集含叠氮基的糖蛋白，成功鉴定出多个胰腺癌特异性分泌蛋白，包括β-葡萄糖脑苷脂酶(GBA)和paladin等。特别值得关注的是，该研究首次发现ManNAc类似物能显著增强细胞外囊泡(EV)的产生。在荷瘤小鼠模型中的实验进一步验证了该方法可从血浆中特异性富集肿瘤来源的糖蛋白。该研究为胰腺癌的早期诊断提供了新的技术路径和潜在的生物标志物资源。
胰腺癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤，其五年生存率不足11%，这主要是由于缺乏有效的早期诊断方法。目前美国食品药品监督管理局(FDA)批准的血清生物标志物CA19-9在特异性和敏感性方面存在明显局限，在急慢性胰腺炎、肝炎和胆道梗阻等非肿瘤性疾病中也会升高。因此，开发新的胰腺癌生物标志物发现策略迫在眉睫。
异常糖基化是癌症的典型特征之一，特别是唾液酸化水平的升高与肿瘤进展密切相关。基于这一认识，研究人员在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项创新性研究，将代谢糖基化工程(MGE)与液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术相结合，建立了"MGE-LC-MS/MS"新方法，用于胰腺癌分泌蛋白组的深度分析。
该研究的关键技术方法包括：使用1,3,4-O-Bu3ManNAz对胰腺癌细胞进行代谢标记；通过生物正交点击化学反应实现叠氮标记糖蛋白的特异性富集；利用LC-MS/MS进行蛋白质鉴定；采用纳米粒子追踪分析(NTA)和ExoView等技术对细胞外囊泡(EVs)进行表征；并在患者来源的异种移植(PDX)小鼠模型中验证方法的可行性。研究使用的细胞系包括近正常胰腺细胞hTERT HPNE、胰腺癌细胞系Capan-2以及患者来源的P198和JD13D细胞。
MGE标记分泌蛋白的验证
研究人员首先验证了MGE策略在胰腺细胞分泌蛋白标记中的可行性。通过far-western blot分析发现，1,3,4-O-Bu3ManNAz成功地将叠氮基团整合到了分泌蛋白的糖链中。有趣的是，标记动力学显示在早期时间点(8小时)主要标记高分子量蛋白，而随着时间延长，低分子量蛋白的标记逐渐增加。与细胞表面蛋白标记通常在48-72小时达到峰值不同，分泌蛋白的最佳标记时间窗口为8-24小时。
代谢叠氮标记N-聚糖的细胞系特异性
研究观察到近正常hTERT HPNE细胞的分泌蛋白标记强度反而高于癌性Capan-2细胞，这一看似矛盾的现象可能源于癌细胞中较高的蛋白酶和神经氨酸酶活性。进一步分析发现，不同细胞系中特定分子量范围的蛋白质表现出差异性的叠氮标记模式，提示MGE标记具有细胞系特异性。
叠氮修饰ManNAc类似物主要标记N-连接聚糖
通过糖苷酶处理实验证实，1,3,4-O-Bu3ManNAz处理细胞后，叠氮标记主要发生在N-连接聚糖上，而非O-连接聚糖。这一发现也排除了非特异性蛋白标记的可能性，表明1,3,4-O-Bu3ManNAz是MGE应用的优越标记剂。
质谱鉴定叠氮标记蛋白
采用MGE-LC-MS/MS方法，研究人员从hTERT HPNE和Capan-2细胞的分泌蛋白组中分别鉴定出47和28个特异性蛋白，其中18个为两者共有。值得注意的是，一些已知的癌症相关蛋白如癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)和间皮素(MSLN)在Capan-2样本中被成功鉴定。此外，还发现了两个没有已知N-糖基化位点的蛋白——suprabasin(SBSN)和FAM3C，它们可能通过EVs被富集。
代谢通路分析确认细胞系特异性叠氮标记
通过DAVID生物信息学工具和KEGG通路富集分析，研究发现叠氮标记蛋白参与了21条代谢通路。例如，补体和凝血级联通路仅在Capan-2细胞中富集，而溶酶体通路在两种细胞中均有发现，但在癌细胞中更为显著。这些发现为理解癌症特异性糖基化变化提供了机制见解。
β-葡萄糖脑苷脂酶作为细胞系特异性标记范例
β-葡萄糖脑苷脂酶(GBA)是一个典型的例子，虽然它在正常和癌细胞中均有表达，但仅在癌细胞中被叠氮标记。这一特性使其成为潜在的MGE-based生物标志物，展示了MGE策略在区分癌性与正常蛋白方面的优势。
常规LC-MS/MS分析患者来源胰腺癌细胞的分泌蛋白
对患者来源的P198和JD13D癌细胞系进行常规LC-MS/MS分析，共鉴定出2163个蛋白质，其中2127个为三种细胞系所共有。值得注意的是，有11个蛋白质仅在两种癌细胞系中发现，构成了胰腺癌特异的生物标志物候选库。
MGE与LC-MS/MS联用增强患者来源细胞系中癌症选择性生物标志物检测
将MGE与LC-MS/MS联用后，在患者来源细胞系中鉴定出了2146个蛋白质，其中69个为两种癌细胞特有，而近正常细胞中缺失。这一数量是常规LC-MS/MS方法的6倍，显著提升了癌症特异性生物标志物的发现能力。
MGE增强EV分泌促进敏感癌症生物标志物分析
研究发现1,3,4-O-Bu3ManNAz处理能显著增强EVs的产生，在鼠源KPC细胞中增加约20.3倍，在人源SW1990细胞中增加约5.5倍。机制研究表明，这一效应与四跨膜蛋白表达谱的改变相关，特别是CD9表达上调和CD63表达下降。这种EV分泌的增强有助于富集低丰度的生物标志物。
MGE-LC-MS/MS富集分泌蛋白具有宽动态范围
多变量分析表明，MGE-LC-MS/MS方法对不同丰度蛋白质的检测没有明显偏倚，适用于宽浓度范围内的生物标志物发现。
体内比较LC-MS/MS与MGE-LC-MS/MS在荷人胰腺瘤小鼠血清分泌蛋白分析中的应用
在移植了人胰腺肿瘤的免疫缺陷小鼠模型中，MGE-LC-MS/MS成功地从血浆中富集并鉴定了肿瘤来源的人源蛋白。虽然鉴定出的蛋白质总数少于常规LC-MS/MS，但首次实现了活体内肿瘤分泌蛋白的特异性富集和鉴定。特别值得注意的是，丝聚合蛋白2(FLG2)是唯一仅通过MGE-LC-MS/MS鉴定出的蛋白质，可能与胰腺癌相关。
研究结论与讨论部分强调，该研究建立的MGE-LC-MS/MS策略为胰腺癌生物标志物发现提供了强有力的新技术平台。该方法不仅能够增强低丰度癌症特异性蛋白的检测灵敏度，还能通过促进EVs产生来富集传统方法难以发现的生物标志物。特别重要的是，研究首次在体内模型中验证了MGE策略的可行性，为未来临床转化奠定了基础。此外，研究发现1,3,4-O-Bu3ManNAz处理能显著改变EVs的生物学特性，这为基于EVs的癌症诊断和治疗策略开发提供了新思路。
该研究的创新性在于将代谢糖基化工程与蛋白质组学分析有机结合，克服了传统分泌蛋白组学分析中的动态范围限制问题。通过特异性富集癌症相关糖蛋白，该方法显著提高了生物标志物发现的效率和特异性。未来，这一策略有望应用于其他类型的癌症研究，为癌症早期诊断提供新的技术路径和生物标志物资源。
