双色膜型免疫球蛋白导向的杂交瘤筛选技术，用于选择性及加速单克隆抗体的生产

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：Dual-color membrane-type immunoglobulin-directed hybridoma screening for selective and accelerated monoclonal antibody production

本研究开发了一种新型双色膜型免疫球蛋白杂交瘤筛选方法（MIHS），通过设计融合目标抗原与溶解析标（MBP）、生物素化标签（BAP）的重组抗原X-HBM，简化了传统方法需制备多个抗原的流程，并利用双色荧光标记实现非特异性抗体的实时排除。以线粒体酶CARS2为模型抗原，筛选效率提升约8倍，成功通过单一抗原获得特异性抗体。

　　

梅川梅（Mei Kawamura）|久保藤菜野（Fujino Kuba）|坂口淳美（Atsumi Sakaguchi）|大石康成（Kosei Oishi）|杉山智也（Tomoya Sugiyama）|宇治江和奈（Wakana Ujiie）|村山壮（Soushi Murayama）|藤泽雄介（Yusuke Fujisawa）|菊池纱弥香（Sayaka Kikuchi）|田中良一郎（Yoichiro Tanaka）|郑敏敬（Minkyung Jung）|森田雅信（Masanobu Morita）|赤池高明（Takaaki Akaike）|栗原康之（Yasuyuki Kurihara）

日本神奈川县横滨市保土谷区横滨国立大学工程科学研究生院，邮编240-8501

单克隆抗体（mAbs）是生命科学和医学中的重要工具，因为它们具有高特异性和选择性结合特性。然而，其生产过程较为繁琐。传统的杂交瘤筛选方法（基于有限稀释法）需要反复手动操作和长期培养，这会延缓目标抗体的分离速度。为了简化这一过程，我们之前开发了一种膜型免疫球蛋白导向的杂交瘤筛选（MIHS）方法，该方法可以直接检测膜结合的B细胞受体与荧光标记抗原之间的相互作用。不过，制备多种可溶性抗原仍然是一个挑战。因此，我们设计了一种重组抗原X-His-BAP-MBP（X-HBM），其中目标抗原（X）与可溶性标签（MBP）、生物素化标签（BAP）和用于纯化的His标签融合在一起。我们建立了一个双色MIHS系统，将免疫、筛选和评估整合到一个工作流程中。双色荧光标记技术能够区分并排除产生针对MBP或标签序列抗体的杂交瘤，从而精确分离出分泌针对目标抗原抗体的杂交瘤。以线粒体酶CARS2作为模型抗原，使用该方法得到的目标阳性杂交瘤比例比传统方法提高了约8倍。仅通过单一可溶性抗原制备，就成功获得了特异性mAbs。该方法即使在使用了可溶性标签的情况下，也能实现抗原特异性和实际可溶性，从而高效地筛选出抗原特异性杂交瘤。

章节摘录

化学品

除非另有说明，所有化学试剂均购自富士胶片和Wako纯化学公司（日本大阪）。限制性内切酶来自Takara Bio公司（日本滋贺）。

动物实验

根据动物福利规定，所有动物均在受控的温度和湿度条件下饲养。动物实验方案已获得横滨国立大学动物实验伦理委员会的审查和批准（批准编号：Animal-2025-5）。

重组抗原的生产和生物素化

示意图

利用单一可溶性抗原设计的双色MIHS方法概念

在传统的MIHS工作流程中，需要分别制备并溶解三种不同的可溶性抗原：一种用于免疫，一种用于荧光MIHS筛选，另一种用于基于生物素的ELISA（SAST）。为了简化这一过程，我们设计了一种重组抗原X-HBM，其中目标抗原（X）与可溶性标签（MBP）和生物素受体肽（BAP）融合在一起。该重组抗原被用于所有实验步骤，包括免疫、MIHS筛选等。

讨论

我们的研究将双色排除技术引入MIHS方法，建立了新的筛选系统——双色MIHS，该系统能够在筛选过程中实时区分并排除由可溶性标签产生的抗体。这项研究解决了传统MIHS的两个实际问题：对可溶性抗原的需求以及由于标签免疫原性导致的非特异性克隆的污染，从而实现了快速高效地生成特异性mAbs。

CRediT作者贡献声明

梅川梅：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，方法学，研究，数据分析。久保藤菜野：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，方法学，研究，数据分析。坂口淳美：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，验证，方法学，研究，数据分析。大石康成：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，方法学，

写作过程中的人工智能及人工智能辅助技术声明

在准备本工作时，作者使用了ChatGPT（OpenAI）来提高手稿文本的清晰度和可读性。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。

致谢

本研究得到了AMED（项目编号：JP201m0203011J0002和JP15km0908001，针对Y.K.）以及JSPS KAKENHI（项目编号：24K08167，针对Y.K.）的支持。我们感谢Editage提供的英语语言编辑服务。作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益冲突或个人关系。