《Microchemical Journal》：A class-specific and uniform dihydrofolate reductase-mediated fluorescence polarization immunoassay for the detection of antibacterial synergists
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本研究开发了一种基于S.aureus DHFR的荧光偏振免疫分析（FPIA）方法，用于检测五种抗生素协同剂（ASGs）。通过优化条件和分子对接，揭示了DHFR通过三维对齐trimethoprim模板实现类特异性识别的机制。该方法灵敏度高（IC50范围14.9-38.7 μg/L），特异性优于传统抗体方法，并成功应用于牛奶样品检测。
郭柳川|周玲芝|孙志成|潘美娇|徐璐|高文杰|钟丽娟|王晓楠|张启迪|王展辉|梁晓
青岛农业大学兽医学院，中国青岛266109
摘要
抗菌增效剂（ASGs）的广泛使用导致其在食物链中持续残留，对人类健康构成威胁。尽管抗体已被用于免疫测定，但其实际应用受到交叉反应性有限和在ASG家族中结合不均匀的限制。开发一种新型生物识别试剂，实现对五种ASGs具有真正类别特异性和高亲和力的结合，仍然是一个关键的未解决挑战。本研究首次开发了二氢叶酸还原酶（DHFR）受体，该受体能够均匀识别所有ASGs。首先，分别制备了来自S. aureus ATCC 29213、S. pneumoniae R6和M. tuberculosis ATCC 25618的三种DHFR受体。通过比较分析，并通过示踪剂和条件优化，开发出一种基于S. aureus DHFR的高灵敏度FPIA。结果显示，基于S. aureus-DHFR的FPIA对所有5种ASGs的IC50值在14.9至38.7?μg?L?1之间，交叉反应率为38.5%–100%，这是一种高度灵敏、类别特异性且均匀的检测方法。分子对接结果显示，DHFR对所有测试ASGs的均匀识别主要是由它们与三甲氧苄氨嘧啶（TMP）模板的三维对齐驱动的，更好的结构对齐导致了更一致的亲和力。最后，构建的FPIA成功应用于全脂和脱脂牛奶中5种ASGs的检测。总之，本研究不仅展示了基于DHFR的FPIA用于检测五种ASGs的方法，还揭示了其均匀识别的结构基础，为筛选需要类别选择性识别的分子提供了见解，超出了传统基于抗体的系统的能力。
引言
抗菌增效剂（ASGs）是一类在人类和兽医医学中广泛使用的合成小分子药物。三甲氧苄氨嘧啶（TMP）、二氨基呋喃（DVD）、阿迪托普林（ADP）、巴基洛普林（BQP）、奥美托普林（OMP）和布罗迪莫普林（BDP）是常用的抗菌增效剂（ASGs）。这些化合物经常与磺胺类药物或其他抗菌剂（如氟喹诺酮类、β-内酰胺类和四环素类）结合，以增强后者的抗菌效果[1]、[2]、[3]。例如，TMP常与磺胺嘧啶联合用于治疗尿路、胃肠道和呼吸道感染，而DVD常与磺胺喹诺酮类联合用于消除食用动物中的原生动物[4]。然而，这些增效剂在牛奶中的过量残留可能引发严重的过敏和毒性反应，并与致畸、致癌和致突变效应有关，对公共卫生构成严重风险[5]、[6]、[7]、[8]。因此，许多国家和地区在各种食品基质中为ASGs设定了最大残留限量（MRLs）[9]。在日本，所有可食用组织（包括肾脏、肝脏、肌肉和脂肪）中TMP的MRL为50?μg?kg?1，鸡肉中的DVD也设定了相同的限值50?μg?kg?1?1，猪和牛奶中的MRL分别为30?μg?kg?1。在中国，农业部规定动物源性食品中TMP的MRL为50?μg?kg?1
仪器技术，如气相色谱-质谱（GC–MS）、液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）和高性能液相色谱（HPLC）已成为ASGs残留检测的基准方法。然而，它们的广泛应用仍受到设备要求高、操作人员需要高度培训以及样品制备过程耗时等因素的限制[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。免疫测定方法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫层析条和荧光偏振免疫测定（FPIA），由于其用户友好、经济和高效的特点，现在被广泛用作初级筛选技术[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。众所周知，生物识别试剂在免疫测定中起着重要作用。然而，最近报道的针对ASG家族的生物识别试剂（包括多克隆抗体（pAbs）和单克隆抗体（mAbs）显示出较差的识别均匀性。ASG类似物在测定中的交叉反应率（CR）接近100%，表明这些生物识别试剂由于共享的结构骨架而具有优异的均匀识别能力。据作者所知，通过暴露共享骨架设计的针对ASGs的多克隆或单克隆抗体并未实现真正的均匀识别[22]。报道的抗体的亲和力差异很大，观察到的交叉反应率在48.2%到418.7%之间[23]、[24]、[25]。重组抗体、适配体和分子印迹聚合物也未能实现类别特异性识别。因此，迫切需要一种能够均匀且强烈结合ASG家族的新识别元件。
受体作为一种天然的大分子蛋白质，为均匀识别研究注入了新的活力，其活性位点能够识别某一类分析物。迄今为止，已有基于受体的免疫测定方法用于筛选β-激动剂、β-内酰胺类、四环素类和磺胺类药物[26]、[27]、[28]、[29]。这些基于受体的方法的特异性、识别谱和均匀性与基于抗体的方法相当或更好[30]、[31]。然而，对于ASGs的检测，基于受体的测定方法仍大多未被探索。更关键的是，受体实现ASGs类别特异性识别的分子机制仍不甚清楚，需要系统性的研究。
二氢叶酸还原酶（DHFR）作为叶酸竞争物（如ASGs）和几种抗癌药物的作用靶点，已被确定为ASGs的受体[32]、[33]。然而，在不了解DHFR-ASG相互作用的情况下，从这些基于受体的免疫测定中获得的信息往往不足以揭示受体对ASGs的亲和力和特异性的原理，这方面几乎没有相关报道。本研究旨在开发一种通用分析方法，用于同时检测五种抗叶酸增效剂（ASG）药物。我们假设细菌对ASG药物的敏感性与其对这些化合物与目标细菌天然二氢叶酸还原酶（DHFR）的体外结合亲和力相关。此外，不同菌株来源的DHFR蛋白之间的结合亲和力可能存在显著差异。具体来说，细菌对ASG药物的较高敏感性可能与对五种测试ASG化合物的更好交叉反应性（均匀性）相关。为了验证这一假设，选择了两种对ASG敏感的菌株S. aureus和S. pneumoniae（最小抑制浓度MIC为2?mg/L）[34]、[35]，以及对ASG不敏感的菌株M. tuberculosis [36]，进行DHFR提取和随后的均匀性表征。所有修订内容在修订后的手稿中以红色标出。因此，在本研究中，我们建立了一种基于DHFR的均匀荧光偏振免疫测定（FPIA）来检测类别特异性的ASGs，并试图通过分子对接阐明其均匀识别的分子机制。新开发的FPIA最终应用于全脂和脱脂牛奶样品中ASGs的检测。这种基于DHFR的FPIA为检测类别特异性的ASGs提供了全新的技术，其背后的识别机制将有效促进DHFR和ASGs的研究和理解。
材料
分析级NaCl和通用溶剂由莱阳试剂公司（中国莱阳）提供。用于ELISA的平底高结合聚苯乙烯微孔板购自康宁生命科学（美国纽约）。牛血清白蛋白（BSA）、新生小牛血清（NBCS）和脱脂牛奶来自Solarbio（中国北京）。Beyotime（中国上海）提供了TMB显色底物、Tris缓冲液和表面活性剂Tween-20。用于Western Blot（WB）测定的...
基于DHFR的FPIA检测ASGs的原理
ASGs是一类在人类和兽医医学中广泛使用的合成小分子药物。ASGs的过度使用导致其在食物链中的残留，对人类健康和生态系统构成威胁。即使使用抗体作为识别分子来构建免疫测定以检测ASGs，其应用仍受限于较差的广谱性和均匀性。因此，在本研究中使用DHFR受体作为ASGs的类别特异性识别分子...
结论
在本研究中，我们成功构建了基于DHFR的FPIA，实现了ASGs的类别特异性和均匀性检测。结果表明，来自S. aureus的DHFR对ASGs的亲和力远高于来自S. pneumoniae和M. tuberculosis的DHFR。更重要的是，基于S. aureus的FPIA的均匀性优于基于抗体的免疫测定方法。此外，我们揭示了...
CRediT作者贡献声明
郭柳川：撰写 – 审稿与编辑、可视化、验证、软件、方法学、数据分析。周玲芝：撰写 – 审稿与编辑、可视化、软件、方法学。孙志成：数据分析。潘美娇：方法学。徐璐：软件。高文杰：数据分析。钟丽娟：数据分析。王晓楠：撰写 – 审稿与编辑。张启迪：撰写 – 审稿与编辑。王展辉：方法学。梁晓：监督、资源、项目
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本项目得到了国家自然科学基金（编号：31502123）、山东省自然科学基金（编号：ZR2023QC123）以及青岛市科技项目（编号：24-1-8-xdny-21-nsh和24-1-8-xdny-29-nsh）的资助。
