基于光谱特性的LED激发补偿技术，用于稳定荧光发射

《Optics & Laser Technology》：Spectrum-guided excitation compensation of LEDs for stabilizing fluorescence emission

本研究开发四波长LED激发系统并建立温度-电流-光谱模型，提出实时光谱引导激发补偿（SGEC）策略，有效将荧光峰谷波动从2.18%–9.41%降至0.44%–1.25%，确保定量荧光显微术的稳定性。

　　

左焕|赵倩|刘勇|孙蓓妮|庄正飞|陈同生

华南师范大学光电科学与工程学院生物光子学系，激光生命科学教育部重点实验室及广东省激光生命科学重点实验室，中国广州510631

摘要

由于发光二极管（LED）具有稳定性高和易于控制的特点，它们被广泛用作荧光显微镜中的激发光源。然而，LED的输出功率和发射光谱会随温度和电流的变化而变化，这会导致荧光强度的波动，从而影响定量分析的准确性。为了解决这个问题，我们开发了一个四波长LED激发系统，并建立了LED发射的温度-电流-光谱模型。基于该模型，我们实现了一种实时光谱引导激发补偿（SGEC）策略，通过补偿LED不稳定性引起的有效激发变化来稳定荧光发射。使用罗丹明123溶液进行的实验表明，SGEC将荧光强度的峰谷变化从2.18%-9.41%降低到了0.44%-1.25%。在罗丹明123标记细胞和表达YFP的细胞的活细胞成像中也观察到了类似的改进效果。这些结果表明，SGEC有效抑制了由漂移引起的发射不稳定性，为多波长LED系统提供了一种通用的方法，以实现更可靠的定量荧光显微镜技术。

引言

发光二极管（LED）由于其出色的稳定性、快速切换能力和可控性，已逐渐取代了传统的激发光源，成为荧光显微镜中的主要激发光源[1]。然而，由于LED的半导体特性，在从启动状态过渡到热平衡状态的过程中，其输出功率和发射光谱都会发生显著变化。这种不稳定性是由于非辐射复合导致的热量积累，从而增加了结温，降低了发光效率，并引起了光谱位移[2]、[3]、[4]。功率衰减直接改变了传递给样品的激发强度，而光谱位移则进一步改变了由LED光谱与荧光团激发光谱之间的重叠程度所决定的有效激发效率。这些因素共同导致了测量到的荧光信号的波动，因此主动稳定LED的输出对于实现准确和定量的荧光成像至关重要。

大多数关于LED控制和优化的研究都集中在人类视觉和非视觉照明应用上，其中红、绿、蓝（RGB）LED的混合比例被调整以获得白光调制，并优化相关色温、显色指数、色域指数、生物节律影响和蓝光危害等指标[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。通过将蓝色或紫外微LED与钙钛矿纳米晶体或碳点等下转换荧光粉结合，也实现了高效的可见光通信和显示系统[11]、[12]、[13]、[14]。

相比之下，尽管研究较少，但LED在生物和生命科学成像中已成为不可或缺的激发光源。由于荧光激发对波长非常敏感，多波长LED系统被广泛用于激发不同的荧光团。对于定量荧光显微镜来说，保持稳定的激发至关重要。以往的研究提出了针对LED功率衰减的补偿策略[15]、[16]、[17]。然而，光谱漂移的影响却很少受到关注。光谱漂移会改变荧光团的激发效率，并破坏荧光信号强度与LED输出功率之间的线性关系。因此，仅仅稳定总光功率是不够的，无法确保可靠的激发或定量成像精度。尽管现代基于LED的荧光照明系统在功率稳定性和热管理方面取得了优异的成绩，但半导体LED本质上仍然存在温度和电流依赖的光谱漂移。即使光功率保持不变，发射峰值的纳米级位移也会改变与荧光团激发带的光谱重叠，从而改变有效激发效率。这一固有特性无法通过传统的功率稳定技术来解决。

在半导体激光器中，通常使用成熟的波长锁定技术（如外腔光栅反馈或精确的温度和驱动电流控制）来稳定输出波长[18]、[19]。这些方法利用了激光器的固有特性，包括窄线宽、高相干性和明确的腔模式，在这种模式下，稳定单一光谱线就足以实现可靠的波长控制。相比之下，宽带LED缺乏相干腔模式，其发射光谱宽且非高斯分布，整个光谱包络会随温度和电流的变化而变化，而不仅仅是单个峰值的移动。因此，使用LED稳定荧光激发效率面临着根本不同的挑战，因为它需要分析漂移的LED输出与荧光团激发光谱之间的综合光谱重叠情况，而不仅仅是锁定单一波长。

LED的光学特性主要由结温和驱动电流决定[20]、[21]。常见的调光方法包括直流（DC）调制和脉宽调制（PWM）。在DC调光下，改变驱动电流幅度会改变光谱功率分布（SPD），由于带填充效应和量子限制斯塔克效应，发射峰值通常会向蓝侧移动[22]。PWM调光通过高频开关LED来调节亮度，同时保持恒定的峰值电流，从而有效减轻了电流幅度引起的光谱漂移[23]、[24]。然而，在高占空比下，自热会导致带隙变窄，从而引起轻微的红移[25]、[26]、[27]。已经探索了混合DC-PWM调光方案来减少温度引起的光谱变化[28]。然而，大多数现有方法仅关注校正峰值波长的漂移，而很少关注对荧光激发效率同样重要的光谱带宽变化。

在这项研究中，我们提出了一种光谱引导激发补偿（SGEC）方法，利用LED的温度-电流-光谱特性来抑制激发引起的荧光发射不稳定性。我们开发了一个四波长LED激发系统，能够根据监测到的基板温度和驱动电流实时估计光谱变化。通过将光谱漂移模型与比例-积分-微分（PID）控制下的功率反馈回路结合，该系统动态调整LED驱动电流，以补偿由输出功率衰减和光谱位移引起的荧光信号波动。实验结果表明，SGEC方法在样品条件恒定的情况下有效抑制了激发引起的荧光强度波动。进一步使用罗丹明123溶液和活细胞成像的验证证实了其维持稳定激发性能的能力——这是实现可靠定量荧光显微镜的关键要求。

部分摘录

LED的温度和电流依赖性光谱特性

我们实验研究了温度和驱动电流如何影响四种商用InGaN基LED的发射光谱，这些LED的标称峰值波长分别为485 nm、505 nm、520 nm和530 nm。505 nm和530 nm的LED是OSRAM产品（部件编号分别为LV CRBP.01和LT CQBP），而485 nm和520 nm的LED是Hufond Optoelectronics产品（部件编号分别为HF3535D120-3W-485和HF3535D120-3W-520）。这种波长选择覆盖了相应的激发范围

光谱引导激发补偿框架

当将开发的LED光源集成到荧光显微镜系统中，并且荧光团浓度、检测光学系统和成像参数保持不变时，测量的荧光信号$F$