《Toxicon: X》：Analytical approaches to uncover the hidden identity of non-extractable organic soil contaminants - a synopsis
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本综述系统评述了区分土壤中不可提取残留物（NER）三种类型（物理包裹型、共价结合型、生物成因型）的前沿分析策略。作者重点阐述了同位素标记（14C、13C、15N、2H）结合顺序提取、硅烷化、化学降解及生物分子分析等技术，强调了其在化学品持久性（P）评估和长期风险预测中的关键作用，为监管机构提供了重要的方法论支持。
1. 有机化学品的生物降解性测试
全球合成化学品的产量持续增长，目前已有约35万种化学品及其混合物注册商用。这些有机化学品一旦进入环境，可能经历迁移、挥发、生物或非生物降解、植物吸收以及在土壤或沉积物基质中的固定等过程。易于生物降解的污染物会从环境中消除，而难降解的污染物则可能在环境中积累数十年，对生物体构成危害。
了解有机化学品的环境归趋对于保障公众和环境健康至关重要。因此，全球权威机构如欧洲化学品管理局（ECHA）实施了多项法规（例如REACH），要求化学品在获批前进行实验室测试。每种年产量≥10吨的化学品制造商都必须对其持久性（P）、生物累积潜力（B）和毒性（T）进行测试。化学品的持久性根据OECD测试指南，在地表水、废水、土壤或水-沉积物系统中进行生物降解性测试评估。通常将同位素标记的测试化学品加入参考系统，以精确量化同位素在系统内的分布（即同位素质量平衡），最长培养时间为120天。
同位素标记存在于矿化产物（例如CO2、N2、H2O）、未转化化学品或其转化产物的可提取残留物，以及作为不可提取残留物（NER，也称为“土壤结合残留物”）存在于剩余固体基质中，共同构成同位素质量平衡。虽然矿化产物和可提取残留物可以轻松地使用分析技术进行定量和鉴定，但由于其化学鉴定面临的分析挑战，NER的评估常常是一个“黑箱”。
矿化和NER结果为P评估提供了基线。例如，高的矿化值（>70%，在一定时间范围内，例如在Zahn-Wellens测试中7天内）表明该化学品的“P”性低。相反，低的矿化（<5%）加上NER形成高于70%则表明该化学品不易生物降解，但有相当一部分转化为了NER。当NER的化学身份未知时，这会引发对化学品安全性的质疑。因此，在监管生物降解性测试中，获得NER的详细化学身份对于有机污染物的P评估至关重要。
2. 不可提取残留物（NER）：定义、类型及相关风险
“NER”这一术语在过去四十年中不断演变，其定量依赖于在提取污染物及其转化产物后，对固体基质中剩余同位素标记的测量。根据最近的分类，NER是“污染物在 exhaustive 提取后，仍保留在土壤中，吸附在固体基质反应表面的残留物”。NER可以通过污染物与固体基质的物理化学相互作用形成，也可以是生物和非生物降解的结果，包括外源性NER（Xeno-NER）和生物成因NER（Bio-NER）。
目前，根据形成机制，NER被分为三种类型。前两种是Xeno-NER类型1和Xeno-NER类型2。类型1 NER是污染物或其转化产物被“锁”在土壤团聚体的微小孔隙中（此处称为“物理包裹”）。类型2 NER是污染物通过不同的强共价键（例如酯、酰胺、醚或碳-碳连接）化学结合到固体基质的反应基团上。类型3 NER（Bio-NER）仅包含生物分子，如氨基酸或脂肪酸，这些来源于微生物降解者的生物量。微生物在生长过程中可以利用污染物元素（如C、N或H）来构建其生物量。死亡后，生物量残留物（坏死物质）可以被其他微生物回收或稳定在固体基质中形成生物成因NER。
这三种NER类型的环境风险各不相同：类型1存在再迁移风险，类型2具有持久性，而类型3在生态上是无害的。区分类型1和类型2 NER，可以采用土壤有机质的硅烷化。类型1 NER因其随时间推移的再迁移风险而受到环境关注，尽管此类NER的毒性被认为低于可提取残留物。类型2 NER由于与固体基质形成强共价键，其再迁移潜力很低或没有。类型3 NER对环境无关注，因为它们包含天然化合物，是土壤或沉积物中自然产生的有机质的组成部分。通过同位素标记区分Xeno-NER和Bio-NER对于污染物的P评估及相关再迁移风险至关重要。
3. NER在持久性评估中的相关性
NER的纳入对化学品的持久性评估具有显著影响。化学品的降解半衰期取决于不同的假设情景。由于NER对计算半衰期的影响，欧洲化学品管理局（ECHA）更新了关于持久性（P）、生物累积性（B）和毒性（T）的指南，要求纳入NER，并强调先进的NER表征对于监管决策的重要性。
4. 分离可提取和不可提取残留物的提取技术
在分析NER之前，需要制定一个两步提取程序，从环境基质（如土壤、沉积物和生物组织）中分离可提取残留物。该提取程序也旨在评估污染物对生物体的生物可利用性和生物可及性。生物可利用性指的是生物体可自由利用的污染物，而生物可及性则包括生物可利用和潜在生物可利用的污染物。
评估生物可利用性采用化学和生物学方法的结合。化学方法涉及三步法：评估环境溶液中的“自由”溶解污染物（步骤1）、“温和”（步骤2）和“剧烈”（步骤3）溶剂提取。在 exhaustive 提取之后，仅含有NER的基质（步骤4）被进一步分析以区分三种NER类型。
5. NER化学身份表征：逐步程序
溶剂提取后剩余在固体基质中的同位素标记，进一步进行硅烷化或EDTA提取，或氨基酸提取。硅烷化或EDTA提取旨在破坏土壤团聚体，释放包裹在微小土壤孔隙中的污染物（类型1）。硅烷化将功能团（例如-OH、-COOH、-NH2）中的H原子替换为三甲基硅烷基（–Si(CH3)3）基团，破坏了与腐殖质的金属桥联中的氢键，导致表观团聚体分裂成更小的亚基。这个过程释放出物理包裹的残留物（类型1 NER），而共价结合的残留物（类型2 NER）则保留在基质内。作为硅烷化程序的替代方案，也可以使用EDTA提取来区分类型1和类型2 NER。
为了量化生物成因NER（类型3）的量，即掺入微生物生物量的残留物，固体基质在剧烈条件下（例如6 M HCl，110°C）水解以释放氨基酸，这些氨基酸由标记的母体物质形成。然后通过GC-MS进一步定量游离氨基酸，并使用气相色谱-同位素比值质谱（GC-IRMS）测量其同位素富集度。
稳定同位素（13C、15N或D）最适合在生物分子水平上详细研究Bio-NER的形成（Bio-NER类型3）。相比之下，放射性同位素（14C或3H）更适用于区分Xeno-NER类型1和类型2，因为它们能够明确、快速地对液体或固体中的放射性标记进行定量。
6. 顺序化学降解以表征NER类型1和2
获取污染物与固体基质相互作用或结合模式信息的一种策略是顺序应用不同的化学降解技术。这种降解反应的主要目的是直接将共价结合的NER分子从大分子天然有机质上断开。
首次尝试使用顺序化学降解是由有机地球化学家进行的，目的是获取近期和化石材料中天然大分子的分子结构和连接信息。作为有价值的降解方法，主要应用了碱性和酸性水解、路易斯酸（三溴化硼BBr3、碘化氢HI）的醚裂解以及各种试剂（如RuO4或MnO4）的氧化反应。
值得注意的是，化学降解方法不仅释放直接连接的污染物，天然大分子有机质也会因化学处理而发生改变和部分断开。因此，被包裹或包封的NER部分也变得可用于常规提取程序。因此，应用降解反应可以分析两个不同的NER库，即特异性共价结合的化合物（Xeno-NER类型2）以及通过物理相互作用结合的结合或包裹的化合物（Xeno-NER类型1）。
7. 用于NER鉴定的放射性同位素：案例研究
有机化学品的环境归趋评估通常依赖于使用放射性标记的测试物质，特别是那些用14C或3H标记的物质。其中，14C因其化学稳定性（半衰期长）、低能量β发射以及可以将放射性标记纳入测试分子特定、代谢相关位置的可能性而被广泛优选。
土壤中的典型归趋研究涉及将放射性标记物质受控施加到土壤微观世界中，然后进行定期采样和顺序提取。可提取的放射性可以使用薄层色谱（TLC）或高效液相色谱（HPLC）结合放射性检测器进行分析。液体闪烁计数（LSC）仍然是定量测量总放射性的金标准。
将HPLC/TLC放射性分析与LSC相结合，可以全面、稳健地评估化学品在土壤中的归趋。这种集成的分析方法对于识别持久性转化产物、估算降解速率和表征NER至关重要。
8. 应用于Bio-NER（类型3）表征的稳定同位素
稳定同位素标记被广泛用于在生物分子水平上追踪有机底物的微生物降解过程。在这种方法中，测试底物中给定元素的天然最丰富的稳定同位素的原子被更重、丰度较低的同位素在特定位置（例如，最抗降解的位置）替换。
与放射性同位素相比，稳定同位素在自然界中丰度更高。土壤或沉积物有机质中天然丰富的重同位素与来自底物的重同位素重叠。因此，必须从样品中减去这种“重叠”。为了校正这一点，必须在标记底物培养的同时，平行培养未标记的对照（无底物和未标记底物）。
添加标记底物并培养后，可以量化给定系统中从底物到Bio-NER的同位素质量平衡和同位素流。稳定同位素质量平衡的测定方式与放射性标记方法类似。不是使用LSC，而是使用元素分析仪-同位素比值质谱（EA-IRMS）来量化矿化产物（13CO2除外）、可提取和不可提取残留物中的同位素标记。
在生长过程中，微生物从标记底物中挖掘C、H或N等元素来构建其细胞的化学区室，即生物大分子（蛋白质、核酸、多糖或脂质）。微生物死亡后，标记的生物量残留物（例如蛋白质、脂质、多糖）要么作为Bio-NER稳定在固体基质中，要么被其他生长的微生物回收。在每个连续的降解步骤中，标记的矿化产物（例如CO2、H2O、N2O或N2）不断从系统中释放出来。
标记生物分子的定性和定量分析可用于不同目的。生物大分子可以揭示负责底物代谢的微生物的系统发育或功能信息。小分子（单体）如脂肪酸可以提供关于微生物活性及参与标记底物转化的主要微生物群组的“粗略”信息。微生物细胞中最丰富的单体——氨基酸——用于估算由标记底物形成的Bio-NER总量。脂肪酸也可用于量化总Bio-NER，但由于它们在土壤中周转快，不如氨基酸合适。
9. NER表征方法的优点、缺点和协同作用
使用同位素标记的化合物是研究有机污染物监管生物降解性测试中NER的核心。两种主要方法——使用放射性同位素（例如14C、3H）的放射性标记和使用稳定同位素（例如13C、15N、2H: D）的稳定同位素标记——在定量和表征复杂环境基质（如土壤、沉积物或污泥）中的NER方面提供了互补的优势。
定量和灵敏度：放射性标记的化合物，特别是那些用14C标记的，提供了无与伦比的灵敏度。使用LSC作为定量方法或加速器质谱（AMS），这些标记使研究人员能够在非常低的水平——低至fmol/mL到pmol/mL尺度——定量化学品及其残留物。这种高灵敏度在研究总质量平衡和追踪化学品进入NER时特别有利。
结构解析和机理洞察：稳定同位素的一个主要优点是它们能够促进转化产物和NER的结构解析。NMR、HR-MS或IRMS技术允许进行结构表征和精确追踪同位素掺入（例如13C、15N）到分子结构中。相比之下，放射性标记技术提供的结构信息有限。
NER表征和区分：在由OECD等机构制定的P评估框架中，区分不同类型的NER至关重要。放射性标记允许直接定量总NER，包括通过常规溶剂无法提取的共价结合或封存部分。这种能力使放射性标记的化合物成为监管质量平衡和持久性研究的“金标准”。
环境真实性和适用性：放射性同位素的一个关键限制是由于健康、安全和监管限制，它们不能用于户外或长期实验。放射性标记的研究必须在严格控制的实验室环境中进行，并配备适当的防护和废物处理系统。稳定同位素规避了这些问题。
结合放射性和稳定同位素提供了一条协同前进的道路。放射性标记提供全面的质量平衡数据和总NER定量，而稳定同位素则提供结构细节和机理洞察。两者结合使用可以提供污染物环境归趋的全貌。
10. 研究问题
最近的D标记应用显示了轻松区分无害的Bio-NER和潜在有害的Xeno-NER类型1的巨大潜力。由于D同位素在Bio-NER中的保留极微，D标记允许跳过Bio-NER的分析。因此，在D方法中，只需要进行硅烷化或EDTA提取来区分类型1和类型2 Xeno-NER的形成。如果需要，Bio-NER的量可以通过总NER减去Xeno-NER来计算，或应用MTB模型估算。硅烷化或EDTA后释放到液体提取物中的D同位素将归属于类型1。
然而，液体提取物中的D定量可能具有挑战性。硅烷化或EDTA试剂含有大量的H以及天然丰度的D同位素，这会“掩盖”源自D标记污染物的D同位素。为了改进D定量，可以将液体提取物蒸发，并将干燥样品中剩余的D同位素热解为D2O，并使用EA-IRMS定量。但仍然不能排除蒸发过程中D从液体提取物中损失的可能性。
D标记虽然前景广阔，但仍难以转化为实践，即被工业制造商所应用。稳定同位素标记并非监管生物降解性测试中同位素质量平衡的标准方法。因此，制造商和监管机构在稳定同位素标记方法方面没有或经验非常有限。D标记的替代方案可能是氚（3H = T）标记。T的天然丰度（10?16%）远低于D（0.01%），因此，T同位素在液体提取物或固体中的测试物质的定量分析将不受天然丰度T同位素的限制。与D标记相比，T标记的另一个优点是可靠且快速的T放射性检测。
此外，关于重同位素标记的污染物的生物或化学转化过程是否会因质量依赖性同位素效应而改变，以及改变到何种程度，目前知之甚少。一般来说，已知给定化合物中的轻同位素与其重同位素相比行为略有不同，例如，降解速度比重同位素类似物快。这种称为“稳定同位素分馏”的效应被广泛用于监测和量化天然丰度重同位素标记测试化学品的生物降解过程。这种质量依赖性同位素分馏效应在放射性同位素中也被预期存在。然而，目前尚未进行该方向的研究，应开展相关工作以填补这一知识空白。
