《Cell Reports》：Distances and charges along the Orai1 nexus-TM3 interface control STIM1 binding and pore opening
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本研究针对STIM1介导的Orai1钙通道激活机制中nexus-TM3界面构象动态变化不清的关键问题，通过整合非天然氨基酸光交联、化学交联与点突变技术，揭示了该界面扩张是STIM1结合触发孔道开放的关键步骤，其疏水性与电荷特性调控信号向孔区的传递，为理解CRAC通道功能调控及相关疾病机制提供了新见解。
钙离子（Ca2+）作为重要的第二信使，调控着基因表达、肌肉收缩、免疫应答和细胞增殖等诸多关键细胞过程。其中，钙释放激活钙通道（CRAC通道）是细胞外Ca2+内流的主要途径之一，尤其在免疫细胞中扮演着核心角色。CRAC通道由位于质膜上的成孔蛋白Orai1和内质网钙感受器STIM1组成。当内质网钙库耗竭时，STIM1发生构象重排、寡聚化并迁移至内质网-质膜连接处，结合并激活Orai1，引发Ca2+内流。STIM1或Orai1的突变会导致CRAC通道功能丧失或增益，引发严重免疫缺陷、Stormorken样综合征或管状聚集性肌病等疾病，凸显了深入理解CRAC通道精确分子调控机制的生理和病理重要性。
Orai1形成一个独特的六聚体复合物，每个单体包含四个跨膜（TM）螺旋。其中，六个TM1螺旋形成高度Ca2+选择性的孔道，该孔道被六个TM2-TM3螺旋环和外围的TM4所包围。孔道开放由STIM1结合到Orai1的主要耦合位点——C末端所启动，进而触发整个通道的一系列构象变化。Orai1的C末端通过所谓的nexus区域连接到TM4，该区域被认为对于孔道开放至关重要。然而，在生理相关的STIM1介导的孔道开放过程中，nexus-TM3界面的精确构象变化及其作用仍然不清楚。
为了解决这一难题，研究人员在《Cell Reports》上发表了题为“Distances and charges along the Orai1 nexus-TM3 interface control STIM1 binding and pore opening”的研究论文。本研究旨在揭示Orai1通道复合物内nexus-TM3界面在通道开放过程中的分子机制和必需的构象重排。
为开展研究，作者主要应用了以下关键技术：1. 遗传密码扩展技术，用于在Orai1蛋白特定位点引入非天然氨基酸；2. 全细胞膜片钳技术，用于记录STIM1介导的钙电流；3. 荧光共振能量转移技术，用于检测STIM1与Orai1之间的相互作用；4. 钙成像技术，用于监测胞内钙浓度变化；5. 分子动力学模拟与pKa值计算，用于理论分析界面特性。所有实验均在HEK293T细胞系中进行。
研究结果
Photocrosslinking UAAs at sites in the nexus and opposite in TM3 allow UV-induced current reduction upon STIM1-mediated activation
通过在nexus和TM3区域对侧位点引入光交联非天然氨基酸（如Azi和Bpa），研究人员发现，在nexus区的K265位点和TM3区的R167位点引入Azi后，STIM1介导的电流显著增强，而UV照射后电流降低至野生型水平。这表明这些位点间的距离变化在激活过程中起关键作用。相反，在上部nexus-TM3界面（如H171Azi和L174Bpa），UV照射则引起电流进一步增强。FRET实验表明UV照射不影响STIM1与Orai1的结合。
Aromatic substitutions at K265 increase STIM1-mediated currents of Orai1
将K265和R167位点突变为芳香族氨基酸（如苯丙氨酸F、酪氨酸Y）后发现，K265F/Y突变显著增强了STIM1介导的电流，而R167的突变则无此效应。双点突变（R167Y K265Y）也能增强电流，但部分组合（如R167F K265F）电流降低，提示局部疏水相互作用可能抑制了开放信号的传递。
Alanine substitutions in TM3 opposite the UAA in the nexus leave the UV-mediated current decrease unaffected but, in some cases, decrease STIM1-induced maximal activation
将K265Azi或R167Azi与TM3中对侧位点（如E166、R170）的丙氨酸（A）突变组合时，UV诱导的电流减少效应依然存在，但某些组合（如K265Azi E166A）的最大STIM1介导电流降低，FRET实验显示其STIM1结合受损，表明这些局部相互作用伙伴在孔道开放和/或信号转导中具有重要功能。
Combination of K265Azi/Bpa or R167Azi/Bpa with mutations triggering constitutive activity eliminates the UV-induced current decrease
将K265Azi或R167Azi与导致Orai1组成型活性（不依赖STIM1）的增益性功能突变（如V102A、H134A、V181K等）组合时，UV诱导的电流减少效应消失。这表明这些增益性功能突变触发了与STIM1不同的构象变化，阻止了UV照射的功能效应，可能由于外周通道段（如非孔道衬里的TM界面）的扩张使交联伙伴难以接近。
Restraining the nexus-TM3 interface via photocrosslinking and chemical crosslinking impairs STIM1-mediated maximal activation
在STIM1结合之前施加UV光照（预先交联）会几乎完全 abolishes K265Azi和R167Azi突变体的STIM1介导电流。使用化学交联非天然氨基酸（BetY、BprY、BptY）或可逆的半胱氨酸交联实验（如Orai1 K265C E166C）也证实，限制nexus-TM3界面的距离会损害STIM1介导的孔道开放， likely 是由于阻碍了构象重排所必需的界面扩张。
STIM1 coupling to and STIM1-mediated activation of Orai1 require charges in the nexus-TM3 interface
电荷突变分析表明，界面内的电荷残基对STIM1结合和孔道开放至关重要。单个电荷中和突变（如E166A、H264A）或电荷反转突变（如E166R、K265E）降低了STIM1介导的电流。双电荷反转突变（如R167E K265E、R170E K265E）甚至损害了STIM1-Orai1结合。静电拯救对突变（如K265E E166R）可恢复电流，强调了特定盐桥相互作用的重要性。理论计算（PROPKA和MC-PBE）预测了相关残基在pH 7时的电荷状态偏好。H264A突变体的pH敏感性和胞外Ca2+浓度依赖性激活动力学与野生型相似，表明H264单独在pH依赖的功能改变中不占主导地位。
Photocrosslinking UAAs located on the opposite side of the upper hydrophobic nexus exhibit strong UV-mediated current activation
对上部的疏水nexus-TM3界面（涉及H171、L174、L261）的研究发现，L261的突变体若其氨基酸大小和疏水性与亮氨酸（L）相似（如缬氨酸V、甲硫氨酸M），则允许STIM1介导的电流和UV诱导的电流增强。而突变为更小（甘氨酸G、丙氨酸A、丝氨酸S）或更大/芳香族（苯丙氨酸F、色氨酸W）的氨基酸则会削弱或消除STIM1介导的激活，但UV交联可部分恢复这种相互作用。这表明上部界面的疏水门控相互作用对于将门控信号从nexus传递至通道复合体中心至关重要。
讨论与结论
本研究揭示了Orai1通道nexus-TM3界面在STIM1介导的孔道开放过程中的关键作用。综合运用位点特异性光交联、化学交联和常规诱变等多种技术，获得了关于该界面关键相互作用模式、空间要求和构象动力学的可靠见解。
研究结果表明，nexus-TM3界面的扩张是STIM1结合触发孔道开放的一个关键构象变化。在界面下部（如K265、R167），引入庞大氨基酸或交联以限制距离的实验证明，STIM1可能诱导了该界面的扩张，而交联则通过限制这种扩张而抑制了通道开放。界面内的电荷残基通过形成盐桥和氢键，精细调控STIM1结合效率和孔道开放。在上部疏水界面（如H171/L174/L261），疏水相互作用的完整性对于信号传递至关重要，其破坏会削弱孔道开放，而光交联可稳定开放构象。
该界面构象变化的信号可能进一步传递至相连的TM3-TM4界面，最终导致中心孔道的开放。研究结果支持了STIM1结合引起nexus弯曲进而触发界面扩张的模型。这些发现为了解CRAC通道激活的分子机制提供了重要细节，突出了nexus-TM3界面作为一个关键调控枢纽的重要性。
该研究不仅增进了对基本生理过程的理解，而且为与CRAC通道功能异常相关的疾病（如免疫缺陷、肌病）的病理机制研究和未来治疗策略的开发提供了新的理论基础。创新的非天然氨基酸技术的应用，为在氨基酸水平上研究蛋白质动态构象变化开辟了新途径。
