从蓝藻Nostoc sp. SW02中快速提取藻胆蛋白的方法，以提高其产量和纯度，并研究其抗癌细胞毒性作用

《Algal Research》：Rapid extraction method for enhanced yield and purity of phycobiliproteins from cyanobacterium Nostoc sp. SW02 and their anticancer cytotoxic properties

螺旋藻蛋白复合物（PBPs）高效提取与抗癌机制研究。采用超声辅助提取结合CaCl2纯化法，从泰国洞穴分离的Nostoc sp. SW02中获最高纯度3.23（化妆品级）的PE为主PBPs，产率达328.14 mg/gDW。通过FTIR证实其官能团特性，并发现该PBPs能以IC50=165.78 μg/mL抑制HeLa癌细胞增殖，通过ROS介导的凋亡及G0/G1期阻滞实现。本研究为开发新型天然色素及抗癌药物奠定基础。

　　

Kasinee Kula|Pradabrat Prajanket|Sutthawan Suphan|Wuttinun Raksajit|Kanjana Tuantet|Wanthanee Khetkorn

泰国帕图姆塔尼府Rajamangala科技大学，科学与技术学院生物系，邮编12110

摘要

蓝细菌中的藻胆蛋白（PBPs）是宝贵的天然色素，在食品和制药工业中得到广泛应用。为了实现商业化生产，获得高产量和高纯度至关重要。本研究提出了一种快速有效的从Nostoc sp. SW02中提取PBPs的方法，避免了后续的纯化过程。提取的PBPs产量最高达到了328.14 mg/gDW，其中藻红蛋白（PE）是主要成分。在优化条件下，藻红蛋白的纯度达到了化妆品级（3.23）。此外，还评估了PBPs提取物的吸收和荧光特性，并利用傅里叶变换红外（FTIR）光谱进行了官能团分析。同时，研究了该提取物对多种癌细胞的细胞毒性，发现其在165.78 μg/mL的浓度下能够抑制HeLa细胞的生长（IC₅₀）。机制研究表明，PBPs提取物通过产生活性氧（ROS）和诱导G0/G1期细胞周期停滞来诱导HeLa细胞凋亡。因此，本研究表明Nostoc sp. SW02是一种新型且可持续的紫色PBPs色素来源，具有在生物技术和制药应用中的潜力。

引言

藻胆蛋白（PBPs）是水溶性色素-蛋白质复合物，存在于蓝细菌和某些藻类的类囊体膜上，作为辅助的光捕获成分，可提高光合作用效率[1]。PBPs含有共价结合的藻胆素发色团，赋予其强烈的吸收和荧光特性[2]。根据藻胆素的组成，蓝细菌中的PBPs可分为三种主要类型：藻红蛋白（PE；深红色；λ_max：490–570 nm）、藻蓝蛋白（PC；深蓝色；λ_max：610–625 nm）和别藻蓝蛋白（APC；蓝绿色；λ_max：650–660 nm）[3]、[4]、[5]。藻胆素具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎和抗癌作用[3]。这些特性支持了PBPs作为天然成分在食品、膳食补充剂、化妆品和药品中的广泛应用，以及其在荧光技术和光动力疗法中的应用[6]、[7]、[8]。

PBPs的商业价值很大程度上取决于其纯度等级。纯度指数超过0.7的产品通常被归类为食品级，超过1.5的为化妆品级，超过3.9的为反应级，超过4.0的为分析级[9]。因此在提取阶段实现高纯度对于减少后续处理步骤至关重要。然而，由于PBPs与细胞膜的结合特性，高效提取面临挑战，需要有效的细胞破裂方法。传统的冻融提取法因其简单性和可重复性而被广泛使用，但该方法处理大量生物量时速度较慢且效率低下[7]、[10]。超声辅助提取（UAE）提供了一种更快速且可扩展的替代方法，因为声空化作用有助于细胞破裂，同时减少溶剂和能量消耗[11]。然而，由于杂质蛋白质的共释放，UAE提取的纯度通常较低，因此需要改进策略以提高产量和纯度。

Nostoc sp. SW02是一种从泰国喀斯特洞穴中分离出的蓝细菌，已被证明是PBPs（尤其是PE）的有希望的来源[5]。在优化营养条件下，该菌株的PBPs产量可达13.89%（w/w），超过了商业菌株Arthrospira platensis的产量[12]。此外，来自Nostoc sp. SW02的PBPs还表现出显著的抗菌、抗氧化和抗癌特性[13]。尽管具有这些潜力，但针对该菌株的高效提取方法仍较为有限。以往的研究尝试使用不同的氯化物盐提取溶剂来提高PBPs的回收率[14]、[15]、[16]。虽然有报道CaCl₂溶液可以增强Spirulina platensis中藻蓝蛋白（PC）的提取效果，但大多数研究使用其他氯化物离子盐来探讨其对适宜提取溶剂的影响。单独使用CaCl₂在超声处理过程中无法获得蓝色藻蓝蛋白提取物，因为其纯度会降低并受到叶绿素的污染[11]、[16]。重要的是，目前尚未评估CaCl₂作为UAE后纯化增强的效果。为了解决这些问题，本研究开发了一种新的一步法，结合了磷酸盐缓冲液中的UAE和随后的CaCl₂辅助纯化。加入CaCl₂可形成不溶性的磷酸钙，有助于吸附细胞碎片和不需要的蛋白质沉淀物[17]，从而通过离心直接分离PBPs。还优化了超声振幅、超声处理时间和CaCl₂浓度，以提高Nostoc sp. SW02中PBPs的产量和纯度。

此外，PBPs作为一种天然色素，因其治疗潜力而受到广泛关注，其抗氧化、抗炎和抗癌特性使其在多种应用中具有多种功能[3]、[18]。最近关于Limnothrix sp. NS01中藻蓝蛋白（PC）抗癌特性的研究表明，它通过多种机制（包括诱导细胞凋亡、细胞周期停滞、抑制DNA复制和产生活性氧（ROS））显著抑制癌细胞增殖[19]。尽管已有许多研究探讨了PBPs提取物的生物活性，但关于Nostoc sp. SW02来源的PBPs的抗癌细胞毒性信息仍然有限。因此，本研究旨在开发一种从Nostoc sp. SW02中快速提取PBPs的有效方法。进一步评估了PBPs的纯度、理化性质和热稳定性，并研究了其在体外对多种癌细胞的细胞毒性作用，重点关注细胞凋亡诱导、细胞周期停滞和活性氧（ROS）生成等机制。这些发现可能为这种天然PBPs色素在营养保健品和制药应用中的使用提供支持。

部分摘要

蓝细菌菌株及培养

本研究中使用的蓝细菌为Nostoc sp. SW02，这是一种丝状蓝细菌，之前从泰国东部的一个喀斯特洞穴中分离得到[5]。Nostoc sp. SW02在2 L Schott Duran玻璃瓶中的1.8 L无菌BG11培养基中培养，培养条件为27 ± 2 °C，持续通入过滤灭菌的空气，并在10 μmol/m²s的荧光灯下照射。当细胞进入对数生长期（OD₇₃₀约为0.8）时，收集培养物用于进一步实验。

快速提取方法下获得高产量和高纯度PBPs的最佳条件

超声辅助提取（UAE）是一种极具前景的绿色提取技术，是一种可持续且高效的方法，广泛应用于食品和生物技术领域[20]。快速提取方法中的细胞裂解步骤被选为提高Nostoc sp. SW02中PBPs的产量。UAE的效果取决于工艺参数，主要参数是超声振幅和提取时间。

结论

目前有多种方法可用于从蓝细菌中提取和纯化藻胆蛋白（PBPs）。然而，许多方法受到提取效率低、蛋白质完整性受损或运营成本高的限制，限制了其在商业领域的应用。因此，开发一种高效提取方法以获得高纯度和具有商业价值的PBPs至关重要。

CRediT作者贡献声明

Kasinee Kula：数据可视化、方法学设计、实验研究、数据分析。Pradabrat Prajanket：撰写、审稿与编辑。Sutthawan Suphan：撰写、审稿与编辑。Wuttinun Raksajit：撰写、审稿与编辑、方法学设计。Kanjana Tuantet：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了泰国国家科学与研究创新基金（TSRI）通过Rajamangala科技大学（项目编号：FRB67E0608/FRB670027/0168）的支持。