全球范围内的赖氨酸2-羟基异丁酰化谱分析揭示了Lactobacillus paracasei PC-01在高密度培养条件下的生长机制

《Biochimie》：Global Lysine 2-Hydroxyisobutyrylation Profiling Reveals the Growth Mechanism of Lactobacillus paracasei PC-01 in High-density Cultures

本研究首次利用质谱蛋白质组学解析了乳酸菌Lactobacillus paracasei PC-01在高密度发酵过程中赖氨酸2-羟基异丁酰化（Khib）修饰的分子机制，发现Khib广泛调控糖酵解、三羧酸循环等代谢通路，并揭示其与菌体增殖的关联，为工业发酵优化提供理论依据。

　　

沈世佳|周润志|王华|李宏阳|高帅森|余杰

教育部乳品生物技术与工程重点实验室，内蒙古农业大学，中国呼和浩特市

摘要

赖氨酸2-羟基异丁酰化（Khib）在调节生物过程中的重要性日益明显，但其在原核生物中的功能意义，尤其是在Lactobacillus paracasei PC-01中的作用仍知之甚少。本研究利用质谱蛋白质组学技术探讨了Khib在L. paracasei PC-01高密度发酵中的调控机制。共检测到1361种蛋白质上的6783个Khib位点，其中73.48%的蛋白质含有多个Khib位点。GO和KEGG富集分析表明，Khib影响细胞功能和代谢途径，尤其是与核糖体活性和蛋白质生物合成相关的途径。随后发现，L. paracasei PC-01中由Khib介导的调控网络显示，糖酵解、TCA循环、嘌呤代谢、氨基酸代谢和脂肪酸生物合成途径中大多数显著上调的酶都发生了Khib修饰。本研究阐明了Khib修饰在L. paracasei高密度培养中的生物学功能，并为制备高效活性益生菌制剂提供了理论基础。

引言

蛋白质翻译后修饰（PTMs）是生命复杂机制中不可或缺的调控元素[1]，在多种生物过程和代谢途径中起着重要作用[2]、[3]。在真核生物和原核生物中已发现超过400种PTMs[4]。近年来，在成熟蛋白质的赖氨酸残基上还发现了新的短链脂肪酸修饰，如2-羟基异丁酰化（Khib）、谷氨酸酰化（Kglu）、丙酰化（Kpr）、琥珀酰化（Ksu）和丙二酰化（Kma）[5]。这些PTMs通过调节蛋白质的空间构象、稳定性、亚细胞定位、相互作用网络和酶活性来影响信号转导[6]和基因表达[7]。然而，这些修饰在不同物种中的作用存在差异，需要进一步探索[8]、[9]。

Khib修饰最早于2014年在哺乳动物细胞的组蛋白中被发现；其添加的元素结构（C₄H₇O₂）在质谱分析中导致质量增加186.0368 Da[10]。随着蛋白质组学的发展，最近的研究表明Khib也存在于各种细胞中的非组蛋白上[4]。Khib修饰在带正电的赖氨酸侧链上添加一个亲水性的2-羟基异丁酰基，这可能干扰辅因子结合或引发构象变化，从而改变蛋白质功能[11]。Khib存在于多种原核和真核生物中，参与与生长和发育相关的多种生理功能，包括转录、翻译和代谢调控[12]、[13]、[14]。迄今为止，已在动物（包括人类[14]）、植物（Oryza sativa和Glycine max）、真菌（Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus flavus、Fusarium graminearum和Candida albican）以及细菌（Proteus mirabilis和Escherichia coli）中报道过Khib的存在[12]。

迄今为止，Khib的研究主要集中在哺乳动物细胞和植物上；关于原核生物的研究仍然有限[12]。有研究表明CobB是一种赖氨酸去2-羟基异丁酰化酶，可调节原核生物的糖酵解和细胞生长。他们分析了一种由Khib控制、CobB催化的分子机制，该机制调控代谢酶活性和细菌细胞发育。此外，还发现RNA乙酰转移酶TmcA是一种参与E. coli转录调控的赖氨酸2-羟基异丁酰转移酶。尽管Khib参与特定生物过程，但其在原核生物中的更广泛生物学意义仍不明确。因此，需要确定Khib修饰蛋白质在原核生物中的功能。值得注意的是，目前尚未报道Khib在益生菌乳酸菌中的存在和功能，尤其是在高密度发酵这一关键工业压力阶段。这是一个重要的研究空白。

另一方面，具有重要益生菌功能的Lactobacillus paracasei（如西藏来源的PC-01菌株）已被证明能够增强肠道屏障[19]、降低儿童感染风险[20]、缓解特应性皮炎[21]，并且具有优异的发酵适应性和储存稳定性[22]；然而，在高密度发酵过程中，其存活率和代谢活性对工艺参数极为敏感，这限制了高效活性制剂的制备。因此，分析该菌株在高密度发酵中的潜在Khib调控机制将为理解其分子层面的应激反应和通过靶向调控提高工业发酵稳定性提供关键依据。

在本研究中，我们首次对L. paracasei PC-01进行了定性蛋白质组学测序，以识别蛋白质组中赖氨酸残基上的Khib修饰，并比较了不同生长阶段Khib修饰的表达差异，以确定Khib修饰与Lactobacillus生长和增殖之间的潜在关系。本研究阐明了Khib修饰在乳酸菌中的生物学功能，为制备高效活性益生菌制剂提供了新的理论基础和技术支持。

章节片段

菌株活化与高密度培养

本研究使用的L. paracasei PC-01菌株来自中国内蒙古农业大学的乳酸菌培养 kolec tion。将L. paracasei PC-01在MRS培养基中于37 °C活化24小时，然后每12小时传代一次，以在厌氧条件下获得更好的活性。第三代菌株在5 L MRS培养基中培养，并在32.5 °C和恒定pH 5.9的条件下进行高密度发酵。

鉴定L. paracasei PC-01中的2-羟基异丁酰化蛋白质

在恒定pH 5.9的高密度发酵条件下，L. paracasei最初生长缓慢，经历6–10小时的迟滞期，随后在32.5°C下迅速生长，19.5小时时达到生长高峰，此时活菌数为（2.22 ± 0.31）× 10¹⁰ CFU/mL（图1A）。为了研究不同L. paracasei生长阶段蛋白质的PTM分布，我们使用了泛抗乙酰赖氨酸、抗2-羟基异丁酰赖氨酸、抗琥珀酰赖氨酸和抗肉豆蔻酰赖氨酸抗体进行了Western blot分析。

讨论

Khib修饰通过调节蛋白质活性、亚细胞定位和相互作用网络，在各种生物（包括细菌）的代谢和环境压力适应中发挥重要作用[25]、[26]、[27]。然而，Khib修饰图谱与乳酸菌生长和代谢之间的功能关系尚未明确。本研究首次概述了L. paracasei PC-01在高密度发酵过程中的Khib修饰情况。

我们

结论

我们确认了L. paracasei在高密度发酵过程中存在Khib修饰。基于质谱蛋白质组学技术，首次全面表征了L. paracasei PC-01中的Khib修饰，共检测到1361种蛋白质上的6783个Khib位点。比较不同生长阶段修饰蛋白质的差异，揭示了Khib修饰在Lactobacillus增殖中的调控机制和生物学意义。这些发现将有助于准确理解...

CRediT作者贡献声明

周润志：撰写 – 审稿与编辑。沈世佳：撰写 – 初稿。余杰：项目管理、概念构思。高帅森：数据分析。李宏阳：数据整理。王华：实验研究。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们衷心感谢内蒙古自治区自然科学基金（2024MS03017）、内蒙古自治区草原人才青年创新人才培训计划（Q2022008）以及内蒙古农业大学青年教师科研能力提升计划（BR220107）的支持。

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