利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分离出了Phyllanfranchins A–D这两种未被描述的具有细胞毒性的二瓣萜类化合物（属于dichapetalin杂合三萜衍生物），这两种化合物是从Phyllanthus franchetianus植物中提取得到的

《Bioorganic Chemistry》：UPLC-Q-TOF-MS/MS guided isolation of phyllanfranchins A–D, two pairs of undescribed cytotoxic dichapetalin hybrid triterpenoid epimers from Phyllanthus franchetianus

从景天科植物Phyllanthus franchetianus地上部分分离出四个新型二氢齐墩果烷型四环三萜（phyllanfranchins A–D），通过UPLC-Q-TOF-MS/MS、NMR、X射线晶体学等解析其结构。其中化合物1对六种癌细胞（IC50=3.38–5.21 μM）显著抑制，对正常细胞低毒（IC50>40 μM），机制研究显示其通过Bcl-2/Bax通路调控线粒体膜电位。

　　

应欣|牛王辉|尚家欢|李娜|朱洪涛|杨兴志|李红梅|李晓年|张英俊

中国科学院昆明植物研究所植物化学与天然药物国家重点实验室，中国昆明 650201

摘要

通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）引导的分离策略，从Phyllanthus franchetianus H. L'ev.（大戟科）的地上部分获得了四种新的二瓣萜素杂化三萜类化合物，即phyllanfranchins A–D（1–4）。这类天然产物中，苯乙基片段与dammarane C-3和C-29的连接方式，以及C-25位被4-羟基苯丙酸酯化的特征非常独特。其结构通过光谱分析、核磁共振（NMR）计算、DP4+概率分析、计算电子圆二色性（ECD）方法和X射线晶体学得到了阐明。值得注意的是，化合物1–2和4对六种人类癌细胞系（HL-60、K562、A549、HepG2、MDA-MB-231、SW480）（IC₅₀ = 3.38–40 μM）和一种正常细胞系BEAS-2B（IC₅₀ = 25.3–40 μM）表现出潜在的细胞毒性。其中，化合物1对所有六种肿瘤细胞系均显示出强烈的活性（IC₅₀ = 3.38–5.21 μM），而对正常细胞的毒性较低（> 40 μM）。机制研究表明，化合物1通过Bcl-2/Bax信号通路改变线粒体膜电位来诱导A549细胞凋亡。

引言

恶性肿瘤是全球第二大死亡原因，因此迫切需要开发高效低毒的新抗癌药物。迄今为止，全球批准的抗癌药物中有一半以上来源于天然产物[1]，这为发现新的先导化合物奠定了重要基础[2]、[3]。二瓣萜素型三萜类化合物（DTTs）是由dammarane型三萜类化合物的A环与2-苯基吡喃结构融合而成的，具有很强的抗肿瘤活性[4]、[5]。迄今为止，大约有100种新的DTTs仅从两个属中报道：Dichapetalum（大戟科）和Phyllanthus（大戟科）[6]。这些分子通常分子量约为600 Da，其特征是在C-2′位置有苯基取代基，C-7、C-21和C-22位置频繁发生羟基化，C-25和C-26位置常有甲氧基化。因此，在串联质谱（MS/MS）中可以观察到与水分子中性丢失（M ? 18）⁺、羟基（M ? 17）⁺和甲氧基（M ? 31）⁺相对应的多个峰，以及由苯基断裂产生的特征碎片离子（M ? 78）⁺。

Phyllanthus L.（大戟科）属主要包括灌木或草本植物，少数为乔木，全球约有1200种，其中中国记录了33种[7]、[8]。传统中医长期使用多种Phyllanthus物种来治疗从肝脏疾病（黄疸、肝炎）和代谢问题（糖尿病）到皮肤问题（湿疹、疣）、头痛、眼疾和腹泻等多种病症。迄今为止，从Phyllanthus中分离出的萜类化合物主要存在于灌木和乔木中，而在草本植物中较为罕见[5]、[9]、[10]、[11]、[12]。Phyllanthus franchetianus是一种高度为1–2米的灌木，主要分布在中国四川和云南地区。从P. franchetianus的地上部分分离出了四种具有独特6/6/5/6/5五环骨架的木脂素，这些木脂素表现出显著的抗炎和保肝活性[13]。此外，从整株植物中还获得了九种对一氧化氮（NO）生成具有中等抑制活性的二萜类化合物（IC₅₀ = 18.1–44.2 μM）[14]。我们之前的研究还发现了七种ent-cleistanthanes和ent-pimaras二萜类化合物，它们对五种人类癌细胞系（急性早幼粒细胞白血病HL-60、肺癌A549、肝癌HepG2、乳腺癌MDA-MB-231、结直肠癌SW480）具有中等细胞毒性（IC₅₀ = 5.01–32.41 μM）[10]。在继续寻找Phyllanthus中的DTTs过程中，采用了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS-MS）引导的分离策略来探索潜在的新分子。通过对P. franchetianus进行硅胶柱色谱分离得到的六个组分（Fr. A–F）进行UPLC-MS-MS（正离子模式）分析，发现Fr. A在19.993–26.560分钟的时间内检测到多个分子离子峰，其m/z值在599–689之间，这与DTTs的分子量相符。进一步将Fr. A通过RP-18柱分离成五个子组分（Fr. A1–A5），并进行了广泛的UPLC-MS-MS分析。最终在Fr. A5中发现了目标峰，其m/z值为20.456–21.466。此外，m/z值为631的前体离子峰产生了失去-OH（m/z 613.352）、苯环（m/z 537.334）的碎片峰，而甲氧基化的组分产生了两种未描述的细胞毒性二瓣萜素杂化三萜类化合物异构体phyllanfranchins A–D（1–4）（图1）。

部分摘要

一般信息

ESIMS数据在Waters Xevo TQ-S（Waters，德国不来梅）上记录。光学旋转在P-1020偏振仪（JASCO，日本东京）上进行。UV数据在Shimadzu UV2401PC分光光度计（Shimadzu，日本京都）上获得。ECD光谱在Chirascan仪器（Applied Photophysics Ltd.，英国）上测量。NMR光谱在Bruker AV-600仪器（Bruker Biospin GmbH，德国卡尔斯鲁厄）上记录，¹H和¹³C NMR分别工作在600和150 MHz频率下。

结构鉴定

Phyllanfranchins A（1）和B（2）分别以无色单斜晶体和白色无定形粉末的形式获得。它们的分子式为C₃₉H₅₀O₇，通过高分辨率电喷雾离子化质谱（HRESIMS）（m/z 653.3449/653.3447 [M?+?Na]⁺，计算值为C₃₉H₅₀O₇Na⁺，653.3449/ 653.3449）得到确认，对应的饱和度为15%。1和2的¹H和¹³C核磁共振（NMR）光谱（表1）非常相似。

结论

总之，从P. franchetianus中分离出了四种具有细胞毒性的新二瓣萜素杂化三萜类化合物（phyllanfranchins A–D）。通过多种光谱方法、DP4+分析和X射线晶体学的结合，阐明了它们的结构。通过UPLC-Q-TOF-MS/MS成功分离出了含有DTTs的组分。此外，还阐明了1的特征MS/MS裂解途径。另外，发现phyllanfranchin A（1）具有...

CRediT作者贡献声明

应欣：撰写——原始草稿、方法学、研究、资金获取、数据管理、概念构思。 牛王辉：研究、数据管理。 尚家欢：研究。 李娜：撰写——审阅与编辑、监督、数据管理。 朱洪涛：研究。 杨兴志：研究。 李红梅：研究。 李晓年：研究。 张英俊：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：32270426）和重庆市教育委员会科学技术研究计划（编号：KJQN202402720）的支持。我们感谢中国科学院昆明植物研究所植物化学与天然药物国家重点实验室的分析和生物活性筛选小组的工作人员在光谱数据和抗肿瘤活性测定方面的帮助。