《Journal of Chromatography A》：Modeling-Prediction-Based-HPLC-MS/MS with Stable Isotope Labeling: A Strategy for Static-Dynamic Profiling of Sphingolipid Alterations in Hepatocellular Carcinoma
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鞘脂质代谢网络在肝细胞癌中的动态研究：创新性结合稳定同位素标记与建模预测策略，首次系统揭示葡萄糖与棕榈酸对肝癌细胞及正常肝细胞鞘脂质代谢的协同调控机制，鉴定出220种鞘脂质中85种呈现葡萄糖/棕榈酸/共培养响应差异，其中35种为共表达标志物，为肝癌代谢重编程研究提供新方法。
唐正坤|韩青哲|陈月|尹义迪|张毅文|徐华荣|李青|张倩
中国沈阳药科大学药学院，国家与地方联合工程实验室（中国药材质量控制关键技术），中国沈阳110016
摘要
肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌。其发生和发展与异常的脂质代谢密切相关，尤其是鞘脂的代谢变化。稳定同位素被认为是研究复杂脂质代谢网络的强大工具。然而，由于脂质的结构复杂性，实现全面和靶向检测仍然具有挑战性。本研究创新地将稳定同位素标记技术与“建模-预测”策略相结合，以实现高靶向覆盖率的检测和同位素峰的准确量化。此外，本研究采用了一种“静态-动态”分析方法，来研究和比较葡萄糖和棕榈酸对HepG2细胞和LO2细胞中鞘脂水平的影响。共检测到220种鞘脂，其中95种对葡萄糖有显著反应，86种对棕榈酸有反应，85种对两者都有反应。值得注意的是，有35种鞘脂在所有条件下都表现出差异表达。稳定同位素标记显示，以葡萄糖为底物合成的鞘脂具有更广泛的同位素分布和更高的13C标记率，这表明在我们的实验条件下，葡萄糖通过多种代谢途径对鞘脂相关碳池的贡献比外源性棕榈酸更广泛。通过整合静态和动态分析，进一步表征了肝细胞癌中的鞘脂变化谱型，从而能够预测鞘脂代谢物的合成和消耗趋势。总之，本研究有望为复杂鞘脂代谢网络的研究提供新的见解。
引言
肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，占所有肝癌病例的80%[1]。肝脏是脂质代谢的中心器官。HCC常与脂质代谢紊乱有关，如脂质过度积累、脂质分布改变、氧化应激、脂质过氧化以及胆固醇代谢的重编程[[2], [3], [4], [5]]。脂质是参与细胞膜形成、能量储存和信号转导的重要分子[6]。它们主要分为八类：脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、固醇脂、萜醇脂、糖脂和聚酮类[7]。脂质代谢的失调在癌症等疾病中起着关键作用，尤其是在鞘脂的调节方面，包括神经酰胺（Cer）、鞘磷脂（SM）、鞘氨醇（Sph）和糖鞘脂。鞘脂不仅是细胞膜的结构成分，还在信号转导、细胞识别、神经功能和病理反应中发挥多种作用[8]。由于鞘脂在癌症、神经退行性疾病和代谢紊乱中的关键作用，它们已成为生物医学研究的关键领域，具有重要的临床应用潜力[9]。
葡萄糖（Glc）和棕榈酸（PA）是鞘脂从头合成的重要底物[10]，也是饮食中的关键成分。以往的研究主要集中在葡萄糖对鞘脂合成的影响[11]或外源性棕榈酸摄入对鞘脂合成的影响[12]上。然而，这些研究通常仅限于单一因素，缺乏对它们在鞘脂合成中差异和相互作用的全面调查。鉴于它们与肝细胞癌的关联[13]，研究它们相互作用对鞘脂合成的影响对于理解肝细胞癌的发展机制至关重要。
靶向脂质分析能够实现脂质的绝对定量，为检测肿瘤细胞中脂质含量的变化提供了有力工具。虽然它提供了有价值的静态信息，但它本质上只能捕捉样本中脂质组成的静态“快照”，仅反映特定时间点的脂质分子丰度。因此，它无法捕捉时间动态或代谢途径的活性，也无法准确确定这些途径中的脂质合成、转化或降解速率[14,15]。相比之下，稳定同位素标记实验可以追踪脂质代谢的动态变化，提供对代谢途径活性和关键酶功能调节的更深入见解[16]。尽管这两种方法具有互补性，但以往的研究很少将静态脂质丰度数据与动态代谢通量数据结合起来，从而限制了对复杂脂质代谢网络的全面分析。这种结合两种方法的研究策略显著推进了对脂质代谢调节及其在生理和病理条件下具体作用的理解[17,18]。
在当前研究中，脂质结构的多样性和复杂性使得脂质标准品昂贵且难以全面获得。这给针对特定脂质类别的深入分析带来了重大障碍。为了解决这些挑战，开发了一种“建模-预测”策略[19,20]，该策略无需标准材料即可实现脂质定量。此外，靶向稳定同位素标记实验依赖于对代谢物中同位素标记丰度和分布的精确测量。然而，复杂的同位素峰的干扰限制了标记脂质的全面检测和准确量化[21,22]。当应用于稳定同位素标记实验时，“建模-预测”策略允许快速和高覆盖率地检测脂质同位素峰，实现高精度的定性和定量分析。
本研究探讨了在棕榈酸（PA）和葡萄糖（Glc）影响下正常肝细胞（LO2）和肝癌细胞（HepG2）中鞘脂代谢的复杂动力学。LO2细胞和HepG2细胞暴露于PA和Glc 24小时后，使用HPLC-MS/MS分析了鞘脂的变化及其功能效应，揭示了鞘脂代谢的调节机制，并提供了HCC中鞘脂变化的全面谱型。此外，“建模-预测”策略被有效地应用于稳定同位素标记实验，动态和静态脂质组学方法的整合使得在Glc和PA作用下的鞘脂变化能够得到全面分析和比较，为HCC中复杂的鞘脂变化网络提供了宝贵的见解。
化学物质、试剂和材料
鞘磷脂标准品（SM d18:1/18:0, SM d18:1/16:0, SM d18:1/18:1, SM d18:1/17:0, SM d18:1/16:0-d31）、神经酰胺标准品（Cer d18:1/18:0, Cer d18:1/16:0, Cer d18:1/18:1, Cer d18:1/20:0）、二氢神经酰胺标准品（Cer d18:0/16:0, Cer d18:0/24:0）、鞘氨醇标准品（Sph 18:0, Sph 18:1）、磷脂酰甘油标准品（PG 16:0-d31/18:1）、棕榈酸（PA）、[U-13C] PA和[U-13C] Glc均购自Avanti Polar Lipids Inc.（美国阿拉巴斯特）。本研究重点分析了二羟基鞘氨醇
“建模-预测”策略的验证
考虑到仪器状态和响应的潜在变化，“建模-预测”策略的定量参数数据库进行了更新和验证。这些更新确保了该策略保持足够的准确性，以满足后续实验的分析要求。使用SPSS开发了一个多元线性回归模型，以碳链长度（CCL）和双键数（DBN）作为自变量，同时考虑了碰撞能量（CE）和去聚类电压
结论
“建模-预测”策略与稳定同位素标记技术相结合，显著提高了同位素峰检测的准确性，并实现了对HepG2细胞中鞘脂含量变化的全面监测（图7）。本研究表明，在我们的实验条件下，葡萄糖通过更广泛的同位素分布，对支持鞘脂合成的碳池的贡献比外源性提供的棕榈酸更广泛
CRediT作者贡献声明
唐正坤：撰写——原始稿件、研究、方法学、数据管理、概念构建、可视化。韩青哲：可视化、方法学、正式分析。陈月：撰写——审稿与编辑、撰写——原始稿件。尹义迪：资金获取、数据管理。张毅文：资金获取、数据管理。徐华荣：资金获取、数据管理。李青：资金获取。张倩：撰写——审稿与编辑、项目管理、监督、资金支持
CRediT作者贡献声明
唐正坤：撰写——原始稿件。韩青哲：数据管理。陈月：验证。尹义迪：研究。张毅文：验证。徐华荣：监督。李青：资金获取。张倩：撰写——审稿与编辑。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号82104126/H3410；项目编号81973464/H3203；项目编号82104379/H3203）；辽宁省科技计划项目（项目编号2022JH2/101300038）；辽宁省自然科学基金（项目编号2021JH2/10300068）；辽宁省高等教育部门基础科学研究项目（项目编号LJKQZ2021033/LJKZ0929）的财政支持。
