探索乳铁蛋白作为创新性的共价固定手性选择剂，利用高效液相色谱法（HPLC）实现药物对映异构体的选择性分离

《Analytica Chimica Acta》：Exploring Lactoferrin as an Innovative Covalently Immobilized Chiral Selector for the Selective Separation of Pharmaceutical Enantiomers Using HPLC

乳铁蛋白经Schiff碱修饰共价固定于环氧单颗粒固定相，构建新型手性选择器用于高效液相色谱分离，成功分离10种药物对映体并验证市售单一手性药物纯度。

　　

阿德尔·埃哈布·易卜拉欣（Adel Ehab Ibrahim）|萨米·G·阿拉米尔（Samy G. Alamir）|加尼姆·阿尔-塔尼（Ghanem Al-Thani）|萨米·埃尔·迪布（Sami El Deeb）|艾哈迈德·阿尔-哈拉西（Ahmed Al-Harrasi）

尼兹瓦大学（University of Nizwa）自然科学与医学科学研究中心，地址：Birkat Al Mauz 616，尼兹瓦市，阿曼

摘要

背景

分子手性对药物的功效和安全性有着深远的影响。因此，在药物开发的所有阶段，手性识别都起着至关重要的作用。乳铁蛋白（Lactoferrin，简称LF）是一种由大约700个氨基酸组成的球状糖蛋白，能够通过其氨基酸残基与其他分子发生多种相互作用。

结果

在本研究中，首次利用Schiff碱作为手性选择剂（Chiral Selector，简称CS），通过共价固定方法将乳铁蛋白（LF）固定在环氧单体柱上。随后，使用LF-CS对18种外消旋药物进行了对映选择性高效液相色谱（HPLC）分离实验。通过优化色谱条件，成功实现了这些药物的对映分离。实验表明，LF-CS作为手性选择剂能够有效分离以下10种药物的外消旋体：西替利嗪（Cetirizine）、奥美拉唑（Omeprazole）、兰索拉唑（Lansoprazole）、达泊西汀（Dapoxetine）、多沙唑嗪（Doxazosin）、奈比洛尔（Nebivolol）、阿替洛尔（Atenolol）、比索洛尔（Bisoprolol）、氯噻酮（Chlorthalidone）和氧氟沙星（Ofloxacin）。此外，还进行了计算机模拟（in-silico molecular docking）研究，以帮助理解分离机制。LF-CS通过氢键、疏水作用、π键、范德华力及静电作用等方式实现了药物的分离。

意义

高效液相色谱（HPLC）仍是药物研究的首选方法，因为它具有更高的灵敏度、可靠性和重复性。本研究首次将乳铁蛋白共价固定在环氧单体柱上，为基于蛋白质的手性固定相技术增添了新的工具。同时，该研究也揭示了仅依赖计算预测的局限性，实际实验表明溶剂效应可能会影响分子的结合亲和力，而这一点在标准模拟中难以体现。

引言

在立体化学中，药物通常被分为非手性、外消旋或对映纯药物[1]。手性分子具有相同的化学式，但表现为两个不可重叠的镜像（对映体），其区别在于中心立体原子上四个取代基的三维排列。尽管对映体具有相同的化学和物理性质，但它们与其他手性分子的相互作用存在显著差异[2][3]。生物系统本身也是手性的：氨基酸主要以L型对映体存在，而碳水化合物则以D型对映体存在[1]。因此，同一种药物的两个对映体可能表现出截然不同的药理或毒理学特性，其中一个可能具有治疗作用，而另一个则可能无效甚至有毒。例如，沙利度胺（Thalidomide）的（R）-对映体具有镇静和治疗效果，而（S）-对映体则具有致畸性[2][4]。这一现象促使人们开发出“手性转换”技术，即将外消旋药物重新制成单一对映体产品以提高疗效和安全性。自1992年以来，美国食品药品监督管理局（FDA）一直强调手性在药物开发中的重要性，包括对原料药和成品药的检测、稳定性研究以及标签标注[1][2][5]。FDA建议手性药物应以单一对映体形式上市，将无活性或无治疗作用的形式视为杂质[6]。据报道，到2000年，单一对映体药物的市场年增长率达到13%，总销售额达到1330亿美元[3]。在2019年冠状病毒疫情期间，S-氯喹（S-Chloroquine）和S-羟氯喹（S-Hydroxychloroquine）显示出比其对应对映体更强的抗SARS-CoV-2活性[7]。因此，仍迫切需要经济高效且可靠的方法来分析和制备手性药物。

现代分析化学提供了专门用于对映体分离和分析的技术，主要依赖于使用手性选择剂（Chiral Selectors，简称CS）的色谱系统。这些选择剂通过立体特异性的分子相互作用来区分对映体。在实际应用中，CS通常以两种形式存在：一种是固定在色谱支撑材料上形成手性固定相（Chiral Stationary Phase，简称CSP）；另一种是作为手性流动相添加剂（Chiral Mobile Phase Additive，简称CMPA）加入流动相[2]。CMPA具有多种实际优势，尤其是简单性、多功能性和低成本。CMPA包括多种类型：手性离子交换剂、手性离子对、大环抗生素、手性包合物（主要是环糊精CD）以及结合CSP的混合系统，以增强分离效果。然而，除了环糊精外，大多数CMPA会吸收紫外线，从而影响质谱（MS）检测器的性能。相比之下，尽管CSP制备成本较高且有一定难度，但仍是目前最常用的对映体分离方法。

手性选择剂可分为几类：Pirkle型（π-复合体）、大环抗生素、多糖、环糊精、冠醚、配体交换型、手性离子交换型、分子印迹聚合物以及基于蛋白质/糖蛋白的固定相[2][8][9]。小分子类CS，如可待因（Codeine）、吗啡（Morphine）等生物碱，也是文献中报道的另一类创新手性选择剂[10][11]。另一类CS是基于多糖的衍生物，如纤维素（Cellulose）和淀粉（Amylose），其衍生化处理可提高它们与多种分析物的相互作用能力，适用于极性和非极性化合物的分离。分子印迹聚合物因其在不同流动相下的形态稳定性而受到关注，有助于提高对映选择性[12]。大环抗生素类CS在经典颗粒柱中表现出优异的手性选择性能，并已被应用于单体柱中[13]。基于蛋白质的系统因其内在的手性而具有对映选择性，可通过结合亲和力的差异及结合位点的数量和空间排列实现选择性识别。此外，蛋白质-药物相互作用具有可逆性。牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）和α1-酸性糖蛋白（α1-Acid Glycoprotein）是最早商业化的蛋白质基CS[14][15]。随后开发了多种新的蛋白质基固定相。然而，在2018至2023年间，关于蛋白质基CSP的发表论文数量少于基于环糊精和多糖的CSP[7][16][17][18]。

乳铁蛋白（LF）是一种哺乳动物体内的球状铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族，与血清转铁蛋白的序列同源性约为60%[19]。LF主要存在于乳清等生物液中，也由人体肠道内源性产生[19][21]。其广泛的分布反映了其多样的生物学功能，包括抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗炎、抗菌作用，以及调节铁代谢、调控细胞生长和清除自由基[20][22]。初乳中LF含量较高，有助于保护母乳喂养的婴儿。这一特性促使LF被应用于多种商业配方，并推动了新型药物和疫苗的研发[19][23]。预计到2033年，LF市场的规模将从2.47亿美元增长至7.11亿美元[24]。

LF的一个关键结构特征是其强阳离子性质，等电点在8.4至9.0之间，使其表面带正电荷，从而易于与阴离子生物分子结合[19]。除了静电作用外，LF的氨基酸残基还能通过氢键、疏水作用、π键和范德华力等非共价作用与其它分子相互作用[20]。这些特性使其成为理想的手性选择剂：其糖基化结构、较大的分子尺寸（约700个氨基酸）、多个结合位点以及多样的相互作用方式。

本研究旨在将LF共价固定在环氧单体柱上，作为亲和性单体色谱（Affinity Monolithic Chromatography，简称AMC）中的新型手性选择剂。AMC利用生物配体作为固定相，具有较大的表面积和孔隙率，从而提高配体的负载量和相互作用效率[7][25]。与将LF作为CMPA使用相比，这种固定方式能避免蛋白质因酸、碱和盐类而变性或失活[26]。此外，固定化的LF能实现稳定的表面介导的对映选择性相互作用，从而提高分离分辨率和稳定性。据我们所知，这是首次报道将乳铁蛋白共价固定在HPLC固定相上用于直接对映体分离的研究。在不同色谱条件下，对多种手性药物进行了分析（具体名称和化学结构见补充材料图S1）。最后，通过分子模拟阐明了分离机制，并将优化后的条件应用于实际药物样品的分析。

化学试剂与材料

磷酸二氢钠（Sodium dihydrogen phosphate）、HPLC级水、乙腈（Acetonitrile，简称ACN）、甲醇（MeOH）和乙醇（Ethanol，简称EtOH）购自德国达姆施塔特的Merck公司。HPLC级正己烷（n-hexane）和硫酸铵（Ammonium sulfate，简称(NH₄)₂SO₄）购自美国宾夕法尼亚州的VWR Chemicals公司。人乳冻干粉中的乳铁蛋白（Lot：SLCG3356）、硫酸（Sulfuric acid）、氰硼氢化钠（NaBH₃CN）、过氧甲基硫酸钠（NaIO₄）、醋酸（Acetic acid）和醋酸铵（Ammonium acetate）购自美国密苏里州的Sigma-Aldrich公司。

通过Schiff连接机制固定乳铁蛋白

乳铁蛋白的来源有两种：人源或牛源。虽然牛源乳铁蛋白价格较低，但由于其更高的分析质量，本研究选择了人源乳铁蛋白作为手性选择剂，有望提高分离精度。预计其较强的结合亲和力将促进与各种手性分子的特异性相互作用，从而提高分离分辨率。

研究局限性与未来展望

本研究的局限性在于缺乏定量分析，因为主要目的是探索乳铁蛋白作为手性选择剂的潜力，而非测定其对映体含量。此外，研究未比较不同固定技术对分离效果的影响。例如，尽管Schiff碱法有效，但可能产生非特异性蛋白质产物。

结论

在本研究中，首次将乳铁蛋白共价固定在环氧单体柱上，作为新型手性选择剂用于亲和性单体色谱（AMC）分析。在优化后的色谱条件下，乳铁蛋白对多种外消旋药物表现出良好的对映选择性。约50%的外消旋体成功分离为相应的对映体。实验表明，LF-CS具有稳定性、重复性和耐用性。

CRediT作者贡献声明

萨米·埃尔·迪布（Sami El Deeb）：撰写、审稿与编辑、概念设计。艾哈迈德·阿尔-哈拉西（Ahmed Al-Harrasi）：撰写、审稿与编辑、资源协调、项目管理。萨米·阿拉米尔（Samy Alamir）：初稿撰写、实验设计、数据分析。加尼姆·阿尔-塔尼（Ghanem Al-Thani）：结果验证。阿德尔·埃哈布·易卜拉欣（Adel Ehab Ibrahim）：撰写、审稿与编辑、监督、资源协调、资金申请、数据管理、概念设计

知情同意声明

不适用。

伦理批准

不适用。

数据可用性声明

研究中呈现的所有原始数据均包含在文章中，如有进一步疑问，请联系相应作者。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

资助

作者感谢阿曼高等教育部、研究与创新部（Ministry of Higher Education, Research and Innovation）在TRC研究项目（项目编号：BFP/RGP/CBS/22/002）下的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本研究结果的财务利益或个人关系。