基于人工智能图像识别技术的侧向流动免疫层析试纸在异丙肾上腺素检测中的应用开发

《Analytical Biochemistry》：Development of an AI Image Recognition–Based Lateral Flow Immunochromatographic Test Strip for Higenamine Detection

检测禁药Higenamine的新方法：结合AI图像识别与金纳米颗粒侧流免疫层析技术，灵敏度达0.49 ng/mL，准确率96.88%，适用于现场快速筛查

　　

张睿|童一阳|史玉萌|蔡茵诺|赵琪|卢阳

天津科技大学食品科学与工程学院，天津市食品安全与健康重点实验室，中国天津300457

摘要

希根胺（HM）是一种天然存在的苯基异喹啉生物碱，存在于植物中，并在2020年世界反兴奋剂机构的报告中被列为S3级禁用物质。为了防止竞技体育中的兴奋剂违规行为，开发及时准确的检测方法至关重要。在这项研究中，我们首次提出了一种结合人工智能（AI）图像识别技术和侧向流动免疫测定（LFIA）的检测方法。该方法利用与HM特异性抗体结合的金纳米粒子（AuNPs）通过LFIA快速检测尿液中的HM。该方法整合了基于AI的图像识别技术，以定量分析试纸检测线的颜色强度。实验结果表明，所提出的方法检测限为0.49 ng/mL，能够在2–8 ng/mL的浓度范围内实现准确识别。为了进行模型训练，我们创建了一个希根胺试纸图像分类数据集。为了解决该数据集的局限性（即样本量小（n = 304）和特征多样性不足的问题，我们提出了一种针对这些约束的改进方案。使用对比度受限自适应直方图均衡化（CLAHE）技术可以更细致地提取特征，从而确保模型在该数据集上的识别精度。在实际尿液检测中，该模型在测试集上的预测准确率为96.88%。这种方法为现场快速检测HM提供了一种高效可靠的技术解决方案，满足了反兴奋剂工作中及时监测的关键需求。

引言

希根胺（HM），也称为诺科克拉林或dl-脱甲基科克拉林，是一种从多种亚洲药用植物中分离出的苯基四氢异喹啉生物碱。这种天然化合物也常见于某些食品和添加剂中。HM最初是从乌头（Aconitum carmichaelii Debeaux，毛茛科）的根中分离出来的^[1]，此后在多种中药（如Aconitum、细辛草、莲子和莲叶）、香料（如胡椒、四川辣椒、肉桂和月桂叶）以及番荔枝果实中也被发现^[2]。研究表明，希根胺对治疗传统呼吸系统疾病有效^[3]，而细辛草（Asarum heterotropoides）传统上用于治疗牙龈疾病，具有很强的抗炎和镇痛作用。然而，摄入含HM产品的运动员可能会出现心率迅速增加的情况，这可能在高强度、高要求的运动中提升表现^[4]。世界反兴奋剂机构（WADA）2020年的反兴奋剂报告将HM列为第二常见的β2受体激动剂（26例阳性检测结果），因此将其永久列为S3级禁用物质^[5],[6]。为了减少含HM产品滥用和兴奋剂滥用带来的问题，已经开发了许多分析方法来检测植物和各种生物或环境基质中的HM。这些方法包括高效液相色谱-串联质谱（HPLC–MS）^[7]、气相色谱-质谱（GC–MS）^[8]、超高效液相色谱-电化学检测（UPLC–ECD）^[9]以及超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS）^{[10],[11]，这些方法都具有高灵敏度和准确性。然而，这些方法需要使用复杂的设备，涉及多个步骤，并且消耗大量有机溶剂。希根胺也可以通过传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测，该方法因其成本效益和高通量处理能力而广受认可2。不过，ELISA检测必须在实验室环境中进行，不适合现场监测。因此，迫切需要开发简单快速的检测方法。基于金纳米粒子的侧向流动免疫测定（AuNP-LFIAs）提供了一个简单、快速且经济高效的现场检测平台，近年来已在食品安全、环境监测和医学诊断中得到广泛应用[12],[13],[14],[15],[16],[17],[18]}

人工智能正在彻底改变医疗行业，通过精确的病变识别显著提高诊断准确性，并实现快速数据处理以提供实时诊断支持。基于这些能力，AI算法也越来越被用于检测后的数据分析^{[19],[20],[21]}。然而，针对小数据集分析的AI方法仍然不够成熟。

在这项研究中，我们开发了一种基于AuNPs的LFIA方法用于敏感检测HM。我们还使用测试结果图像生成了希根胺试纸图像分类（ICHT）数据集，并优化了该方法以适应小样本量。在最终的对比测试中，该方法在ICHT数据集测试集上的分类准确率为96.88%，这得益于我们优化的试纸分类策略和对ResNet架构的改进。

材料与试剂

HM-HCL（98%）购自Adamas Chemical Reagent Co., Ltd.（中国上海）。HM和特雷托奎诺醇（tretoquinol）及其他潜在交叉反应化合物的标准溶液购自Alta Science and Technology Co., Ltd.（中国天津）。甲醇、乙醇和甲酸作为色谱纯试剂使用（Li Chrosolv，默克公司，德国）。牛血清白蛋白（BSA）、4-吗啉乙磺酸（MES）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、氯金酸（HAuCl₄）

AuNP-Ab偶联探针的优化

我们的结果表明，通过添加0.2 M K₂CO₃实现精确的pH控制对于维持偶联物的稳定性和结合效率至关重要。确定K₂CO₃的最佳体积为4 μL，为探针偶联提供了理想的碱性环境。抗体加载实验表明，10 μg的抗体是最优剂量，能够在足够的结合能力和最小的空间阻碍之间取得平衡。对于侧向流动试纸的配置，采用了C线涂层

结论

我们成功开发了一种基于AuNPs的LFIA试纸，其HM检测灵敏度是目前报道中最高的，达到了0.49 ng/mL的检测限。该方法结合了免疫层析技术的速度和AI图像识别的高精度，能够在大约10分钟内实现试纸的准确识别和分类。通过整合和优化现有的AI建模方法以适应小样本量和小目标数据集，我们的方法证明了

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

作者贡献声明

童一阳：可视化、验证、软件、方法学、数据管理。史玉萌：撰写——审阅与编辑、方法学、研究、数据管理。卢阳：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目协调、方法学、概念构思。张睿：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、验证、方法学、研究、数据分析、概念构思。蔡茵诺：可视化、软件、方法学。赵琪：撰写

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本文所述工作的财务或个人利益。

数据获取

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利益冲突声明

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