《Biochimie》：Pre-Amplified dsDNA-Tag Lateral Flow Assay for Highly Sensitive Point-of-Care Detection of Influenza A H1N1
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新型预扩增dsDNA标签侧流层析技术实现H1N1病毒RNA的1 pM检测限，消除扩增污染风险，兼具实验室精度与现场适用性。
王玲玲|周洪宇|卜胜军|陈静友|邢海阳|郝卓|周学章|庞春英|苏玉春|万家宇
中国农业科学院长春兽医研究所，中国长春130122
摘要
目前对甲型流感（H1N1）病毒的即时检测面临灵敏度不足和扩增污染风险的双重挑战。在这里，我们开发了一种新型的侧向流动核酸生物传感器，使用了预扩增的双链DNA标签（PADT）。线性化的M13噬菌体被预扩增以生成一个3.5 kb的双链DNA产物，其中包含一个20个核苷酸的突出端探针和重生物素标签，随后通过夹心式检测策略形成FAM探针/目标RNA/PADT复合物。
结果
该技术实现了对H1N1特异性RNA的1 pM检测限，灵敏度比传统的侧向流动色谱法高出100倍（p<0.01）。这种方法消除了核酸扩增，防止了由于扩增子污染导致的假阳性。通过避免直接扩增目标核酸，有效防止了由产物污染引起的假阳性。这种逐步策略将预扩增与即时检测相结合，在保持现场适用性的同时实现了实验室级别的准确性。预扩增和即时检测的逐步方法结合了实验室精度和现场适用性，可互换的突出端设计为多病毒检测提供了一个平台解决方案。
引言
甲型流感H1N1病毒是一种重要的动物源病原体，自2009年pdm09株出现以来，已经建立了稳定的季节性流行模式，对全球公共卫生安全构成了持续的威胁[1]。根据世界卫生组织的流行病学数据，这种病毒每年感染大约5-10%的成年人和20-30%的儿童，导致29万至65万人死于呼吸道疾病[2]。与SARS-CoV-2类似，H1N1通过抗原漂变和转移来逃避免疫。其表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的快速进化通常会降低疫苗的有效性至40%以下，这突显了快速和精确诊断技术的迫切需求[3]，[4]。
当前的流感诊断方法面临灵敏度和及时性的双重挑战。虽然病毒培养仍然是金标准，但其3-7天的周转时间对于临床决策来说不切实际。血清学检测受到5-7天血清转化窗口的限制，无法区分活动性感染和既往感染[5]。尽管分子诊断方法的检测限（LOD）为3拷贝/μL，但由于实时定量PCR（qRT-PCR）依赖于热循环仪（需要95°C-55°C-72°C的温度循环）和2-4小时的分析时间，在资源有限的环境中应用受到显著限制[5]，[6]。相比之下，侧向流动免疫测定（LFIA）由于其<30分钟的检测时间、室温稳定性和无需特殊设备的要求，成为理想的即时检测（POCT）平台[3]，[7]。然而，传统的LFIA通常只能检测到nm级别的H1N1 RNA（约10^6拷贝/mL），难以满足早期病毒载量较低样本的检测需求（<1000拷贝/μL）。
最近，核酸纳米材料与等温扩增的协同应用显著提高了LFIA的性能。虽然金纳米颗粒（AuNPs）作为经典的比色探针，可以通过DNA-AuNP网络结构将检测限降低到40 pM（约25倍的改进）[3]，[8]，但其信号强度受到表面等离子体共振（SPR）消光系数（约10^8 M^-1 cm^-1）的限制，并且容易受到复杂样本基质（例如痰液中的黏蛋白）的干扰[1]，[9]。更先进的M13mp18噬菌体纳米支架技术能够在20分钟内实现无需扩增的H1N1 RNA检测（LOD=1 pM），通过多价寡核苷酸组装（支架、检测和信号链）[1]。然而，这种技术的支架稳定性较差（在4°C下保存不到7天），批次间变异较大（cv>15%）[2]，[10]。尽管杂交链反应（HCR）可以通过无酶自组装实现指数级信号放大[11]，[12]，但其较长的杂交时间（约2小时）削弱了POCT的优势，而且茎环结构容易受到RNase的降解[5]，[13]。将等温扩增技术（例如RPA、LAMP）与LFIA结合可以实现10-100拷贝/μL的灵敏度[5]，[14]，但仍存在一些固有局限性：(1)引物二聚体引起的假阳性（假阳性率>5%）[6]，[9]；(2)来自扩增子的气溶胶污染风险（污染率：每反应3.2×10^-4）[5]，[15]；(3)由于复杂样本中的抑制剂（例如血红蛋白、肝素）导致扩增失败（失败率：12-18%）[5]，[16]。虽然CRISPR-Cas系统可以通过跨切割提高特异性[17]，[18]，但其多组分性质（Cas蛋白、crRNA、报告分子）增加了操作复杂性，而且试剂在室温下的稳定性不足（t1/2 < 72小时，在25°C下）[4]，[10]。
为了解决这些技术限制，本研究创新性地开发了一种基于预扩增双链DNA标签（PADT）的新型侧向流动检测（LFA）平台。该平台通过以下机制实现高效检测（图1）：首先，使用线性化的M13噬菌体模板通过PCR制备一个约3.5 kb的双链DNA标签，其中包含一个20个核苷酸的单链突出端。在目标RNA（例如H1N1 RNA）存在的情况下，FAM标记的捕获探针、目标RNA和PADT产物形成一个夹心复合物（FAM/H1N1 RNA/PADT）。当该复合物通过LFA条带的测试区时，其生物素部分与链霉亲和素-金纳米颗粒（SA-AuNPs）结合，而FAM部分被固定在测试区的抗FAM抗体捕获。这导致AuNPs的积累，形成可见的红色条带。多余的SA-AuNPs被控制区的生物素捕获，形成第二个红色条带作为内部对照[3]，[19]。
本研究的关键创新包括：1. 稳定性突破：双链DNA结构使得标签在4°C下仍然稳定[2]，[19]。2. 污染控制：预扩增标签与检测系统的物理分离防止了传统等温扩增中常见的扩增子污染[10]，[15]。3. 信号增强：每个标签可以容纳超过200个胶体金纳米颗粒，使信号强度比单链探针提高15倍（检测限：1 pM）[1]，[8]。4. 通用设计：突出端序列易于互换，能够成功适应不同类型的流感病毒（例如H1N1/H3N2）[5]。这种“预扩增标签+即时检测”的逐步策略提供了实验室级别的准确性（与qRT-PCR相当的准确性）和现场适用性（<30分钟的检测时间），为资源有限的环境提供了实用的解决方案[1]，[9]。
试剂和材料
冻干合成寡核苷酸由上海Sangon Biotechnology有限公司提供（表S1）。病毒RNA提取试剂盒（离心柱）由北京Tiangen Biotech有限公司提供。通用SYBR Green qPCR混合液由美国Azaood有限公司提供。无RNase的水和dNTP由Sangon Biotechnology提供。凝胶实验使用Bio-Rad（Hercules，CA，美国）和Azure Biosystems C600仪器（Dublin，CA）进行。
可行性分析
在这项研究中，首先评估了PADT-LFTS系统的捕获能力。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和琼脂糖凝胶电泳分析了各个探针与其相应目标之间的特异性结合相互作用。如图2A所示，与4-6泳道相比，7泳道中有一个明显的亮带。这证明了只有当目标存在时，目标、上游引物和FAM探针才能结合。
结论
本研究开发了一种使用预扩增的双链DNA标签（PADT）的侧向流动检测方法，用于无需扩增的快速检测甲型流感（H1N1）病毒RNA。PADT方法消除了与传统等温扩增（例如RCA、RPA）相关的污染风险，并通过双链DNA信号放大降低了假阳性率。相比现有方法的主要优势包括：1. 高灵敏度/特异性：通过稳定的双链DNA实现pM级别的H1N1 RNA检测
CRediT作者贡献声明
周学章：研究、概念化。庞春英：资金获取。邢海阳：概念化。郝卓：概念化。王玲玲：研究、数据管理。苏玉春：项目管理、概念化。万家宇：资源获取、资金获取。卜胜军：概念化。陈静友：正式分析。周洪宇：撰写——初稿、资源准备
资金来源的格式化
本工作得到了吉林省科学和技术发展计划（编号20230203143SF；20240101203JC）以及吉林省发展和改革委员会项目（编号20230043-6）的财政支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢中国农业科学院长春兽医研究所提供的仪器和设备支持。
