p40包涵体自组装技术：实现多材料无交联酶固定化的创新平台

《International Journal of Biological Macromolecules》：Self-assembling p40 inclusion bodies enable direct functionalisation of diverse materials

本研究针对传统酶固定化方法依赖化学交联剂导致生物相容性降低及活性损失的问题，开发了一种基于p40结构域可逆自聚集的无交联生物功能化策略。通过盐酸胍溶解p40融合蛋白包涵体并诱导其在聚丙烯纤维、纤维素织物等多孔材料上重聚集，实现了82–100%的功能化效率及75–100%的酶活性保留。α-淀粉酶p40功能化纤维在70?°C下连续12次循环保持全活性，塔格糖4-差向异构酶p40在旋转床反应器中稳定催化D-塔格糖合成。该技术为工业生物催化提供了绿色、可扩展的固定化新平台。

　　

在生物技术和材料科学领域，如何将酶高效且稳定地固定到载体表面一直是个核心挑战。传统的酶固定化方法通常依赖化学交联剂，比如戊二醛或环氧基团活化载体，虽然能增强酶的稳定性，但这些化学试剂往往会导致酶结构变形、活性下降，甚至引入生物相容性问题。更麻烦的是，交联过程需要多步反应和严格的条件控制，既增加了工艺复杂性，也可能残留有毒试剂，限制其在食品、医药等敏感领域的应用。因此，开发一种温和、高效且无需化学交联的酶固定化新方法，成为科研界和工业界共同追求的目标。

正是在这一背景下，澳大利亚麦考瑞大学的研究团队在《International Journal of Biological Macromolecules》上发表了一项创新研究，他们利用一种名为p40的蛋白质结构域的自组装特性，成功开发出一种无需交联剂的酶固定化平台技术。p40源自嗜热纤维素降解菌Caldibacillus cellulovorans，本身具有形成不溶性包涵体的天然倾向，但有趣的是，这些包涵体中的蛋白质仍能保持一定的生物活性。研究人员巧妙地将p40与目标酶融合表达，形成p40融合蛋白包涵体，再通过温和的变性剂溶解和重聚集过程，直接将其固定到多种材料表面，形成稳定的酶功能化界面。

这项研究的关键技术方法主要包括：利用p40结构域构建自组装包涵体；通过盐酸胍可控溶解与重聚集实现材料表面功能化；采用傅里叶变换红外光谱分析蛋白质二级结构；通过共聚焦激光扫描显微镜和场发射扫描电镜观察材料表面形貌；使用旋转床反应器评估固定化酶的长期操作稳定性。

3.1. 利用p40融合制备功能性/催化活性包涵体

研究人员将mCherry、eGFP、α-淀粉酶、β-木聚糖酶和塔格糖4-差向异构酶与p40融合，在E. coli中成功表达并纯化得到不溶性包涵体。SDS-PAGE和蛋白质定量显示不同p40融合蛋白的产率存在差异，其中BactAmy_p40的蛋白质含量最高。场发射扫描电镜揭示不同融合蛋白形成的包涵体形态各异：单纯p40为球形聚集体，荧光蛋白融合体呈圆柱状结构，而酶融合体则形成粗糙多孔或柔软珠状聚集体，表明目标蛋白的特性影响包涵体超分子组装。

3.2. 不同材料的生物功能化及其表征

通过盐酸胍溶解p40包涵体后稀释诱导重聚集，成功在聚丙烯纤维、纤维素微纤维、多孔纤维素珠和甲基丙烯酸酯微球等材料表面实现功能化。共聚焦显微镜显示mCherry_p40和eGFP_p40在材料表面形成均匀荧光涂层，而可溶性蛋白对照组无吸附。场发射扫描电镜进一步证实重聚集的p40聚集体紧密附着于材料纤维或孔隙内壁。傅里叶变换红外光谱检测到功能化材料表面出现酰胺I带和酰胺II带特征峰，证实蛋白质成功固定。

3.3. 不同材料的功能化效率与负载容量

定量分析表明，大多数材料的功能化效率达82%–100%。负载mCherry_p40的Immobeads 150P微球在蛋白浓度2–100 mg/mL范围内功能化效率稳定在81%–88%。BactAmy_p40功能化材料保留75%–100%的初始酶活性，其中二维平面材料如纤维素/PET片层活性保留率最高，而多孔珠体因扩散限制活性略有下降。

3.4. 溶解剂对p40包涵体重聚集及结构稳定性的影响

比较不同溶解剂发现，盐酸胍和十二烷基硫酸钠对mCherry_p40的溶解效率最高。但仅盐酸胍处理后的样品能通过稀释诱导重形成功能活性聚集体。傅里叶变换红外光谱二级结构分析显示，盐酸胍溶解重聚集的p40融合体保持β-折叠主导的天然样构象，而硫氰酸胍处理则导致结构无序化，说明溶解剂的选择对蛋白质正确重折叠至关重要。

3.5. 酶-p40功能化材料的操作与储存稳定性

BactAmy_p40功能化聚丙烯纤维在70?°C下12次循环后活性未衰减，80?°C下12次循环后保留50%活性。BactXylB_p40功能化纤维在50?°C下10次循环后活性保留约50%。共功能化纤维同时负载BactAmy_p40和BactXylB_p40，5次循环后分别保留74%和55%活性。T4E_p40功能化材料在70?°C下10次循环后活性保留90%，显著高于游离包涵体。在SpinChem旋转床反应器中，T4E_p40功能化聚丙烯纤维连续10次循环仍保持D-塔格糖合成能力，证明该技术适用于连续流生物工艺。

研究结论与讨论部分强调，p40结构域通过β-折叠介导的可逆自组装机制，为酶固定化提供了无需化学交联的绿色路径。该技术不仅克服了传统共价固定化可能导致的酶活性损失问题，还展现出优异的操作稳定性和材料普适性。傅里叶变换红外光谱和形态学分析表明，盐酸胍诱导的重聚集过程能恢复蛋白质部分天然构象，形成活性聚集体。在旋转床反应器中的成功应用进一步验证了该策略的工业化潜力。未来通过优化融合设计、表面特性调控及反应器参数，p40平台有望在生物制造、生物传感和生物医药材料等领域发挥重要作用。