《Pest Management Science》：Development and application of KASP assays to differentiate between Sorghum bicolor, halepense, and their hybrids
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本文开发了一种基于竞争性等位基因特异性PCR（KASP）的基因分型方法，通过内部转录间隔区（ITS）单核苷酸多态性（SNP591）精准区分栽培高粱（Sorghum bicolor）、约翰逊草（S. halepense）及其杂交后代。该技术成本低至每样本1美分，与牛津纳米孔测序结果高度一致（R2=0.969），成功应用于温室杂交实验（F1个体n=1389）和自然种质鉴定，首次揭示野生群体中杂交频率高达37%，为作物-杂草基因渗入监测提供了可靠工具。
引言：作物与杂草杂交的监测挑战
高粱属作为研究作物与杂草杂交的典型模型，包含栽培作物高粱（Sorghum bicolor）和恶性杂草约翰逊草（Sorghum halepense）。两者因近期共同祖先、重叠物候期及部分兼容的倍性水平（高粱为二倍体2n=2x=20，约翰逊草为四倍体2n=4x=40）可发生杂交，形成三倍体、四倍体等复杂倍性后代。杂交个体常呈现中间表型，与哥伦布草（Sorghum almum）形态相似，导致田间鉴别困难。气候变暖促使高粱与杂草向北扩张，增加了基因流动风险，而除草剂抗性等性状的跨物种转移可能加剧杂草治理难度。现有技术缺乏可靠遗传标记区分杂交个体，亟需开发高效检测工具。
材料与方法：KASP标记设计与验证体系
研究基于ITS区保守SNP591（高粱为T，约翰逊草为C）设计KASP引物，其中高粱特异性反向引物连接FAM荧光基团，约翰逊草引物连接HEX基团。DNA提取采用改良CTAB法，通过梯度PCR扩增（94°C激活15分钟，10个循环的64-56°C退火，37个循环的63°C延伸）。为应对多倍体杂交导致的等位基因剂量差异，研究创建了"伪杂交"对照（DNA混合比例1:1至1:12），并利用几何均值设定基因型判定边界。验证手段包括：牛津纳米孔测序（ITS区936 bp扩增）、温室控交实验（3组亲本组合）以及自然种质（78份）与NPGS种质库（66份）测试。
结果与讨论：精准鉴别与杂交动态解析
同线性分析与KASP解读策略
同线性分析揭示ITS拷贝数分布差异：高粱在1号染色体有1拷贝、5号染色体5拷贝，而四倍体约翰逊草在A亚基因组（1号染色体75拷贝、5号染色体6拷贝）和B亚基因组（11号染色体91拷贝、15号染色体6拷贝）均存在扩增。引物结合位点分析显示约翰逊草引物主要靶向B亚基因组，导致杂交个体荧光信号偏向HEX（约翰逊草）。通过反正切变换（arctan）将KASP荧光比值转化为连续变量，简化了多倍体杂交个体的基因型判定。
纳米孔测序验证技术可靠性
KASP荧光数据与纳米孔测序的SNP频率高度相关（R2=0.969, P<0.001），表明该技术可准确量化等位基因频率。例如，堪萨斯州H生物型KASP显示FAM/HEX比为28.62/55.60（θ=0.4816），纳米孔测序T/C碱基比为813/1620（θ=0.4651），均判定为杂交个体。
温室杂交揭示基因渗入方向
杂交成功率存在不对称性：约翰逊草为雌性时杂交率达67%（S. bicolor♂ × S. halepense♀），而高粱为雌性时未产生杂交后代。以杂交个体为母本的组合中，95%后代为杂交基因型，且荧光信号偏向约翰逊草，可能与约翰逊草ITS拷贝数优势及引物结合偏好性有关。
自然种质鉴定发现广泛杂交
NPGS种质库中3%的高粱种质被重新判定为杂交种，25%的哥伦布草种实为高粱。美国多地采集的78份疑似约翰逊草样本中，37%为杂交个体，表明自然环境中杂交频率远超预期（既往研究报道<2%）。这一结果凸显表型鉴别的局限性及遗传工具的必要性。
结论：高效监测工具的实践意义
本研究开发的KASP技术通过单一SNP实现了高粱、约翰逊草及杂交后代的精准鉴别，成本仅为纳米孔测序的1/1500。其在多倍体系统中的稳健性、对自然群体杂交高频率的揭示，以及种质库误判现象的纠正，为作物-杂草基因流监测提供了关键技术支撑，对应对气候变化下的杂草进化管理具有重要意义。
