开发一种用于快速检测鸡传染性贫血病毒核酸的试剂盒（RPA-LFD方法）

《Journal of Virological Methods》：Development of a rapid detection kit for chicken infectious anemia virus nucleic acid (RPA-LFD method)

鸡传染性贫血病毒检测方法研究及RPA-LFD试剂盒开发，灵敏度达10拷贝/μL，特异性100%，与qPCR一致性100%，适用于现场及实验室快速诊断。

　　

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中国农业科学院上海兽医研究所禽类传染病研究室

摘要

鸡传染性贫血病毒（CIAV）是一种主要的免疫抑制性病原体，对家禽产业造成了巨大的经济损失。该病毒在宿主体内长期存在，难以根除，因此亟需快速、准确的检测方法。在本研究中，我们开发了一种重组酶聚合酶扩增-侧向流动试纸条（RPA-LFD）试剂盒，用于现场检测CIAV。基于251株CIAV全基因序列的保守区域，设计并筛选出了最优引物和探针，确保了高特异性，且不会与其他12种常见禽类病毒发生交叉反应。该试剂盒具有极高的灵敏度，最低检测限为10个CIAV DNA拷贝，仅需15分钟即可完成高效检测。此外，该试剂盒重复性和稳定性良好，在检测50份现场样本时与qPCR结果完全一致（100%一致）。这种CIAV RPA-LFD试剂盒为快速检测CIAV提供了实用工具，适用于现场和实验室使用。

引言

鸡传染性贫血病毒（CIAV）是一种对家禽产业构成严重威胁的新出现病原体（Schat, 2009; Fatoba and Adeleke, 2019）。CIAV可以在鸡体内通过垂直和水平途径传播。该病毒主要攻击免疫系统，导致免疫抑制以及贫血、胸腺萎缩、生长和发育受阻等临床症状。CIAV对免疫系统的损害会导致免疫功能衰竭，从而增加对其他病原体的易感性，进而引发继发感染（Su and Meng, 2019; Li and Yan, 2021; Sun and Yu, 2023）。这些影响会导致生产性能下降和显著的经济损失。

根据国际病毒分类委员会（ICTV）的分类系统，CIAV目前被归类于Anelloviridae科、Gyrovirus属（https://ictv.global/taxonomy）。它是一种单链、环状、负链DNA病毒，无包膜，呈二十面体结构，直径约为25–26.5纳米（Rosario et al. 2017）。CIAV的基因组长度约为2.3 kb，包含三个部分重叠的开放阅读框（ORFs），编码VP1、VP2和VP3三种病毒蛋白（Lacorte et al. 2007）。VP1基因最长且变异最大，包含中和表位编码区（Koch et al. 1995）。相比之下，VP2基因高度保守，可作为通用检测目标。VP3基因具有高度保守的功能区，序列稳定且暴露度较低（Zhang et al. 2013）。一旦CIAV感染鸡体，其DNA会以共价闭合的环状分子形式在宿主体内存活很长时间，难以清除（Imai and Mase, 1999; Bolin and Stoffregen, 2001; Ladekjaer-Mikkelsen and Nielsen, 2002; Van Dong and Tran, 2020; Li and Wang, 2022）。这种长期存在使得核酸检测成为检测CIAV的便捷有效方法（Todd and Mawhinney, 1999; Techera and Tomás, 2019; Kannaki and Priyanka, 2021），但这些方法大多在实验室中使用，通常涉及耗时的过程、复杂的设备要求和高成本。

为了解决这些问题并实现快速便捷的现场检测，环介导等温扩增（LAMP）（Han et al. 2019）和RPA-LFD成为有前景的替代方案（Bian et al. 2022）。与RPA-LFD相比，LAMP需要复杂的引物设计（4–6个引物），且需要更高的能量和设备条件（在60–65°C下进行）。RPA基于三种关键酶的组合，在恒定温度（37–42°C）下扩增DNA。RPA过程始于重组酶与引物结合形成复合物，该复合物扫描双链DNA模板以寻找同源序列。找到匹配后，重组酶使引物侵入DNA双链并置换一条链。单链DNA结合蛋白（SSBs）随后稳定被置换的链，防止其重新结合。随后，链置换DNA聚合酶结合到被侵入引物的3’端并启动DNA合成，从而实现目标序列的指数级扩增。整个过程通常只需15–20分钟，使RPA成为一种极其快速的核酸扩增方法（Bian and Liu, 2022; Onchan and Ritbamrung, 2022）。

在本研究中，我们开发了一种高效RPA-LFD检测试剂盒，具有高灵敏度、高特异性和可视化读数功能。该试剂盒在CIAV诊断和控制方面具有重要的实用价值和市场潜力。

试剂和病毒

病毒、鸡蛋和试剂

CIAV 2823株（GenBank登录号：PX925630）由中国农业科学院上海兽医研究所分离、鉴定并纯化。无特定病原体（SPF）鸡蛋购自浙江丽华农业科技有限公司，在37°C的培养箱中孵育5天后使用。实验室准备了以下病毒：传染性喉气管炎病毒（ILTV）、禽腺病毒

CIAV RPA-LFD试剂盒引物和探针组合的优化

为了确定CIAV RPA-LFD试剂盒的最佳引物和探针组合，共评估了28种不同的组合。首先，使用NTC对这些引物-探针组合进行了测试，所有组合均呈阴性结果，表明没有假阳性，确认了其特异性（图1A）。随后，用含有10个和2个CIAV DNA拷贝的PTC对这些组合进行了测试。组合1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、21、23、25、26

讨论

CIAV是一种重要的免疫抑制性病原体，对家禽产业构成严重威胁（Bhatt and Shukla, 2011; Zhang and Ma, 2024）。自1979年首次分离以来，CIAV迅速在全球范围内传播，1982年进入中国，1992年首次在中国国内分离（Zhang et al. 2013）。该病毒已表现出广泛分布和高流行率，毒力增强，常与其他病原体共感染，影响种鸡和商业鸡群。快速诊断至关重要

资助

本研究得到了国家重点研发计划（项目编号：2023YFD1800601）、国家自然科学基金（项目编号：32573347）和国家重点研发计划（项目编号：2024YFD1800102）的支持。

作者声明

我们确认所有署名作者均已阅读并批准了手稿内容，且未遗漏任何符合作者资格的其他人员。同时，所有作者均同意手稿中列出的作者顺序。

CRediT作者贡献声明

乔阳腾：写作——审阅与编辑、研究。 春秀媛：写作——审阅与编辑、数据管理。 秦芳刘：写作——审阅与编辑、研究。 薛潘：正式分析。 志飞张：数据管理。 邦峰徐：研究。 梅唐：写作——初稿、软件设计、概念构思。 小娜史：方法学研究。 伦书：软件开发、数据管理。 明浩严：方法学研究。 易飞雄：软件开发、数据管理。 大伟严：写作——审阅与编辑、初稿撰写。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。