磁珠辅助提取结合ID-LC-MS/MS技术用于同时定量人血清中的脂溶性维生素A、D、E和K

《Talanta》：Magnetic bead-assisted extraction combined with ID-LC-MS/MS for simultaneous quantification of Fat-Soluble Vitamins A, D, E, and K in human serum

本研究开发并验证了一种基于自动化磁固相萃取（MSPE）与同位素稀释液相色谱-串联质谱（ID-LC-MS/MS）的高通量分析方法，用于同时定量血清中VA、25(OH)D3、25(OH)D2、VE和VK1。方法灵敏度高（R2>0.995），基质效应小，回收率90.48%-101.95%，CV值低于7.14%，准确度验证通过NIST标准参考材料，较传统液液萃取效率提升显著。

　　

潘青青|林静|唐春兰|于涛|沈敏|吴光亮|纪惠岩

参考实验室，医疗系统生物技术有限公司，中国浙江省宁波市315104

摘要

本研究开发并验证了一种基于自动化磁固相萃取（MSPE）与同位素稀释液相色谱-串联质谱（ID-LC-MS/MS）的高通量方法，用于同时准确测定人血清中的五种脂溶性维生素（VA、25(OH)D₃、25(OH)D₂、VE和VK₁）。在MSPE过程中，合成了一种功能化的二氧化硅基磁核壳材料，该材料具有聚（聚苯乙烯-共-二乙烯基苯-共-N-乙烯基吡咯烷酮）涂层，并通过亲水性聚乙二醇间隔臂共价固定了2-乙烯基苯并呋喃亲和配体。这种设计有助于目标分析物的有效富集和纯化。验证后的方法表现出优异的特异性，色谱分离完全，无显著的基质效应或干扰。该方法具有较高的灵敏度和线性，所有分析物的线性响应系数（R²）大于0.995，定量限低（0.15 ng/mL-0.49 μg/mL）。回收率在90.48%至101.95%之间，日内和日间变异系数（CV）分别低于7.14%和4.68%。通过分析NIST标准参考物质SRM 968f和SRM 972a进一步证明了方法的准确性，平均偏差在±7%以内。与传统液-液萃取（LLE）方法相比，自动化MSPE过程通过系统优化在11分钟内高效地从血清中提取了目标分析物。此外，临床常规LLE方法与建立的MSPE方法之间有很好的一致性。该方法在外部质量评估方案中也表现良好，进一步证实了其高准确性和可靠性。这种稳健的方法为临床实践中脂溶性维生素的精确监测和营养状况评估提供了强大的分析工具，并具有促进实验室自动化的潜力。

引言

脂溶性维生素（FSVs，包括A、D、E、K）作为必需的微量营养素，在代谢调节、免疫反应和维持细胞稳态中起着关键作用。由于人体不能内源性合成大多数FSVs，因此其供应依赖于饮食摄入或外源性补充。全球范围内，由FSVs缺乏或过量引起的健康问题日益突出，对公共卫生构成了重大挑战[1]。维生素A（主要是视黄醇，VA）缺乏会导致干眼症、夜盲症和免疫功能受损，而过量摄入可能导致中毒[2]、[3]。维生素D（VD）缺乏，通过其主要形式25(OH)D₃和25(OH)D₂进行评估，不仅与佝偻病和骨质疏松症有关，还与多种骨骼外疾病相关[4]。相反，过量摄入可能导致中毒，引发高钙血症、肾结石和其他并发症[5]。维生素E（VE）的主要活性形式是α-生育酚，其缺乏在早产儿和幼儿中较为常见，可能导致神经病变和贫血[6]、[7]。维生素K（主要是VK₁）对凝血功能至关重要，其缺乏可能导致出血事件，尤其是在新生儿中[8]。因此，建立准确高效的方法来精确测定FSVs对于可靠监测和指导临床干预非常重要。

已经开发了多种分析方法来测定生物基质中的FSVs，包括免疫测定（如CLIA、LFIA）[9]、[10]、电化学分析[11]，以及与各种检测系统结合的高效液相色谱（HPLC），例如VA和VE的紫外检测[12]、VA和VE的荧光检测[13]，以及VA、VD和VE的光二极管阵列检测[14]。然而，免疫测定常常受到交叉反应的影响，导致特异性较差。电化学方法容易受到电极表面污染和复杂基质干扰的影响，从而导致灵敏度和重现性差。HPLC方法通常缺乏可靠的痕量分析所需的灵敏度，并且样品预处理繁琐[15]。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）由于其高灵敏度和特异性，已成为测定FSVs的首选方法[15]、[16]。通过应用同位素标记的内标可以进一步提高方法的准确性和精确度，以校正基质效应并减少实验误差。尽管如此，使用该技术同时测定FSVs仍面临一些挑战，包括：1）广泛的生理浓度范围：FSVs的浓度范围非常广泛，从VK的pmol/L到视黄醇和α-生育酚的μmol/L，需要广泛的样品预处理程序；2）基质效应：生物样品（如血清、血浆）具有复杂的基质，其中内源性脂质可能导致显著的基质干扰，影响离子化效率[17]、[18]。因此，有效的FSVs样品预处理对于减少基质干扰和提高方法特异性和灵敏度至关重要。蛋白质沉淀（PPT）[19]、液-液萃取（LLE）[20]和固相萃取（SPE）[21]是三种常用的FSVs样品预处理技术。尽管SPE方法的纯化和富集能力远优于PPT和LLE，但传统的SPE技术存在固有的局限性，包括填充柱中的高压，以及依赖于离心或过滤的分散模式分离通量低且效率低，使得过程劳动强度大且耗时。

近年来，磁固相萃取（MSPE）越来越多地应用于临床质谱分析的样品预处理中，显示出操作灵活性和高通量等显著优势[21]、[22]、[23]。MSPE使用涂有功能化学基团的磁珠作为吸附剂。这些磁珠在样品基质中的移动和分离由外部磁场控制，从而实现高效快速的样品预处理。该技术不仅显著降低了样品之间的交叉污染风险，还在短时间内完成了复杂的样品纯化过程，适用于多种复杂基质的分析[24]、[25]。已有研究报道基于MSPE的同时提取FSVs（VA、VE和25(OH)D₃），通过磁分离提高了提取效率并缩短了过程时间[26]。然而，迄今为止，尚未有基于MSPE的同时测定所有FSVs（VA、VD、VE和VK）的方法。鉴于评估营养状况的临床需求日益增长，开发一种能够在单次分析中准确测定所有主要FSVs的方法至关重要。

在这项研究中，我们开发并验证了一种高度自动化且成本效益高的MSPE工作流程，结合LC-MS/MS方法，用于同时准确测定人血清中的VA、25(OH)D₃、25(OH)D₂、VE和VK₁。我们成功合成了依次涂有聚（聚苯乙烯-共-二乙烯基苯-共-N-乙烯基吡咯烷酮）涂层、共价固定的亲和配体2-乙烯基苯并呋喃以及亲水性硫醇-聚乙二醇-羟基间隔臂的二氧化硅磁珠。这种材料保持了传统SPE材料的孔径和比表面积，同时实现了快速的磁分离。通过将这些功能化的磁颗粒集成到自动化提取平台中，实现了从血清中高效同时富集和纯化五种目标FSVs。该方法确保了FSVs的有效提取、分离和定量，为早期诊断缺乏或过量提供了可靠的分析工具。该方法表现出高灵敏度、特异性和高样品处理能力，对临床诊断和研究应用具有重大价值。

化学品和试剂

视黄醇（VA）和α-生育酚（VE）购自Sigma（Sigma-Aldrich Co. LLC.）。25(OH)D₃、25(OH)D₂和维生素K₁（VK₁）购自北京贝普瑞生物技术有限公司（北京，中国）。同位素标记的内标包括VA-d₄、VE-d₆、25(OH)D₃-d₃、25(OH)D₂-d₃和VK₁-d₇也购自北京贝普瑞生物技术有限公司（北京，中国）。认证参考物质SRM 968f和SRM 972a购自NIST（美国马里兰州盖瑟斯堡）。HPLC级

Fe₃O₄@SiO₂@PS-DVB-NVP@VBF@PEG6000的特性

磁珠的平均粒径为26 μm（图2a, b），小于5 μm的碎片仅占0.18%。BJH中值孔径为5.5 nm，BJH累积吸附孔体积为0.8 cm³/g，多点BET比表面积为672 m²/g。磁性质测量系统显示，磁珠的饱和磁化强度在外部磁场作用下从-6600 emu/g变化到6600 emu/g（图2c），证实了它们的超顺磁性

结论

本研究成功建立了一种高效自动化的分析方法，将MSPE与LC-MS/MS相结合，解决了同时测定人血清中多种脂溶性维生素的长期挑战，这些维生素具有多样的理化性质、广泛的浓度范围和复杂的基质干扰。该方法的核心是设计和制备了一种多功能磁吸附剂。

CRediT作者贡献声明

纪惠岩：方法学、数据管理。吴光亮：监督、资金获取。沈敏：研究、资金获取。于涛：监督、概念构思。唐春兰：验证、监督。林静：撰写——审阅与编辑、方法学。潘青青：撰写——初稿、方法学

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突。

数据可用性

数据可根据请求提供。

资助

本研究得到了长江三角洲科技创新共同体联合研发项目（2024CSJGG2000）和浙江省重点研发项目（2025C01200）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。