《Analytica Chimica Acta》：Quantitative all-in-one high-performance thin-layer chromatography–
planar start-zone enzyme assay applied for invertase activity
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本研究针对传统分光光度法在复杂基质中酶活性检测准确度不足的问题，开发了一种基于高效薄层色谱（HPTLC）的平面起始区酶活性定量分析新方法。通过将酶反应与产物分离集成于同一吸附表面，实现了对转化酶水解蔗糖及其复杂基质（如鸡蛋饼干提取物）的高灵敏度检测。该方法在纳摩尔级范围内展现出优异的重现性与准确性，所需底物量降低12,500倍，为酶动力学研究提供了更精准的分析工具。
在食品工业和生物技术领域，转化酶（invertase）作为关键催化剂，能够将蔗糖（sucrose, Suc）水解为葡萄糖（glucose, Glc）和果糖（fructose, Fru），广泛应用于糖果、烘焙制品及化妆品中。然而，传统的酶活性检测方法（如分光光度法）存在明显局限性：它们通常仅能提供水解产物的总和信号，无法区分单个产物，且在复杂基质中易受干扰，导致准确性下降。此外，这些方法需要大量底物和酶，操作繁琐且成本较高。因此，开发一种能够精准分析复杂样品中酶活性的新方法成为迫切需求。
为解决上述问题，德国吉森大学的研究团队在《Analytica Chimica Acta》上发表了一项创新性研究，提出了一种定量一体化高效薄层色谱-平面起始区酶活性分析（HPTLC–planar start-zone enzyme assay）方法。该方法首次将酶反应与产物分离、检测集成于同一HPTLC板表面，实现了对转化酶活性的高灵敏度、高特异性定量分析。
研究团队通过优化HPTLC板预处理、酶反应条件（如湿度控制、pH调节）及色谱分离参数，建立了标准化操作流程。关键步骤包括：将底物（蔗糖或鸡蛋饼干提取物）与转化酶依次加样至HPTLC板起始区，在严格控制湿度与温度的条件下进行酶反应，随后直接在同一板上进行产物分离，并通过荧光衍生化试剂（如对氨基苯甲酸，p-ABA）进行检测。该方法无需样本转移，显著降低了操作误差，并利用密度计量法（densitometry）对葡萄糖和果糖进行定量。
3.1. 线性范围与灵敏度
通过系统评估酶反应线性范围，研究发现该方法在5–40 mU/band区间内呈现良好线性（R=0.9803），其检测限（LOD）对于果糖和葡萄糖分别低至30 ng/band和25 ng/band，远优于传统分光光度法（毫摩尔级）。此外，该方法所需底物量仅为分光光度法的1/12,500，凸显其在微量样品分析中的优势。
3.2. 方法重现性与准确性
日内与日间精密度实验表明，葡萄糖和果糖的定量结果相对标准偏差（RSD）分别控制在1–7%和0.4–14%之间，证明该方法具备良好的重复性与可靠性。尤其在使用复杂基质（如鸡蛋饼干提取物）时，其精密度与纯蔗糖底物相当，验证了方法在实际样品中的适用性。
3.3. 复杂基质中的酶活性分析
对比纯蔗糖与鸡蛋饼干提取物中转化酶的活性，研究发现复杂基质中释放的果糖和葡萄糖量均高于纯底物，且转化率（果糖/葡萄糖）超过100%。这一现象提示转化酶在复杂环境中可能表现出转移酶活性（如生成低聚果糖），而HPTLC的分离能力可有效识别此类副反应，这是传统分光光度法无法实现的。
3.4. 与传统方法的对比
与传统分光光度法相比，该平面起始区酶分析法不仅显著降低了试剂消耗，还能通过产物分离提供更详细的酶反应信息。例如，研究发现转化酶对蔗糖的水解并非严格等摩尔进行，且酶活性较高时（≥60 mU/band）会出现产物饱和现象。这些发现对深入理解酶动力学特性具有重要意义。
本研究成功验证了一种创新的定量酶活性分析策略，通过将反应与分离步骤集成于HPTLC平台，实现了对微量酶活性的精准分析。该方法不仅提升了检测灵敏度与特异性，还为复杂基质中酶行为的研究提供了新视角。未来，该技术可进一步应用于其他酶系（如淀粉酶、蛋白酶）的活性监测，推动食品质量控制和生物催化领域的精准分析发展。
