用于测定免疫结合物中螯合剂与抗体比例的微尺度天然尺寸排阻色谱-高分辨率质谱联用技术

《Analytica Chimica Acta》：Microscale Native Size Exclusion Chromatography High Resolution Mass Spectrometry for the Determination of the Chelator-To-Antibody Ratio of Immunoconjugates

免疫偶联物中平均配体数（CAR）的快速检测方法——微流控原位SEC-MS通过优化缓冲浓度（600 mM NH4Acetate）和高CID能量（140 eV）实现20分钟快速分析，适用于多种化学敏感型偶联物（如含巯基/脲基连接剂），有效替代传统放射化学滴定。

　　

安妮卡·A.M. 范德宗（Annika A.M. van der Zon）| 布拉姆·韦耶尔斯（Bram Weijers）| 丹妮尔·J. 维格茨（Danielle J. Vugts）| 安德烈亚·F.G. 加尔加诺（Andrea F.G. Gargano）

阿姆斯特丹大学，范特霍夫分子科学研究所（van ‘t Hoff Institute for Molecular Sciences），分析化学组（Analytical Chemistry Group），科学园区904号，1098 XH 阿姆斯特丹，荷兰

摘要

背景

正电子发射断层扫描（PET）利用放射性标记的抗体（放射免疫结合物）是一种强大的成像技术，用于追踪治疗性抗体的分布。准确测定每个抗体上的螯合剂平均数量（CAR）对于（放射）免疫结合物的表征至关重要，这有助于最大化肿瘤摄取和图像质量。CAR的测定被视为一个关键的质量属性。尽管放射滴定法被广泛使用，但它劳动强度高、耗时且材料消耗大，每个样本大约需要半天的时间。为了克服这一分析瓶颈，我们开发了一种微尺度排阻色谱-质谱（SEC-MS）分析方法。

结果

通过应用微尺度流动，可以使用高浓度的挥发性盐（高达1000 mM的醋酸铵）来最小化二次相互作用。此外，使用了140 eV的高isCID能量来减少加合物的形成并提高质谱的灵敏度。该方法使用基于完整曲妥珠单抗（trastuzumab）的模型放射免疫结合物进行了优化，特别关注缓冲液浓度对色谱效应和CAR测定的影响。最终选择了600 mM醋酸铵作为缓冲液浓度。该方法与放射性核素滴定法进行了比较，用于分析相同的免疫结合物模型，并获得了相似的结果。最后，我们通过测试多种免疫结合物（例如伊匹木单抗（ipilimumab）、利妥昔单抗（rituximab），包括半胱氨酸和赖氨酸连接的螯合剂（例如DFO、DOTA、RESCA），以及其他较小的蛋白质模型（如纳米抗体），证明了该方法的广泛适用性。

意义

优化的微流控原位SEC-MS方法，运行时间仅需20分钟，提供了全面的表征，包括平均CAR、分散度指数、糖基化谱和mAb杂质的信息。关键的是，这种原位方法适用于所有测试的免疫结合物，包括那些含有马来酰亚胺和硫脲键的化学敏感物种，这些物种通常会挑战像RPLC-MS这样的变性方法。这确立了SEC-MS作为放射滴定法的广泛适用的替代方案，用于免疫结合物的全面表征。

引言

正电子发射断层扫描（PET）已成为临床研究中一种强大的成像技术，能够无创地观察和测量分子和细胞过程，例如单克隆抗体（mAb）治疗剂的分布，包括肿瘤定位[1]。PET成像的核心是放射免疫结合物（RIC）的发展，其中利用mAb的高特异性来靶向生物系统内的分子实体（组织、受体等），并将放射性核素传递到这些目标[2]、[3]。

在RIC中，基于金属的RIC在PET成像中最常用。它们通常由三个部分组成：单克隆抗体（mAb）、促进螯合剂与抗体结合的连接剂，以及能够结合放射性核素的螯合剂。连接剂负责保持螯合剂与抗体的稳定连接。这种连接剂-螯合剂组合也称为双功能螯合剂，可以通过半胱氨酸或赖氨酸共轭随机附着[4]。基于半胱氨酸的共轭通常涉及二硫键的选择性还原，而赖氨酸则在非还原条件下进行修饰。由于抗体结构中存在超过40个赖氨酸残基，基于赖氨酸的共轭可能导致更大的异质性，从而提高标记效率，但通常比基于半胱氨酸的共轭具有较低的特异性[5]。为了克服传统赖氨酸和半胱氨酸基方法的异质性问题，现在采用了位点特异性共轭方法来精确控制修饰位点，从而得到更均匀的产品[6]。一般来说，在双功能连接剂附着后，可以用多种放射性核素对结合物进行标记，如碘（¹²⁴I）、铜（⁶⁴Cu）、镓（⁶⁸Ga）、钇（⁸⁶Y）和锆（⁸⁹Zr）[7]。⁸⁹Zr因其较长的体内半衰期和有利的PET特性而常被使用[8]。与⁸⁹Zr形成稳定复合物的最常用的双功能螯合剂是右旋糖酐铁（DFO）[8]。

用于PET成像的RIC中，结合到抗体上的螯合剂的数量由螯合剂与抗体的比例（CAR）定义，通常每个抗体上有1-3个螯合剂。优化CAR的主要目标是最大化肿瘤摄取和图像质量，同时最小化非特异性背景信号。附着多个螯合剂可能会改变抗体的构象及其等电点，从而可能降低其结合亲和力并导致脱靶摄取。1到3的CAR确保了对抗体天然结构和功能的最小干扰。因此，准确测定CAR被认为是RIC开发和表征中的一个关键质量属性（CQA）。

为了测定CAR，通常采用三种方法：（i）放射滴定，（ii）尺寸排阻色谱（SEC），紫外（UV）和（iii）质谱（MS，通常是LC-MS）分析。在（i）放射滴定中，逐渐加入天然的非放射性金属（在这种情况下是⁹⁰Zr），其中含有少量⁸⁹Zr用于检测，直到可用的螯合剂结合位点饱和[9]。通过量化这一饱和点处结合的放射性核素的数量，可以直接评估每个免疫结合物上的平均螯合剂数量。然而，这种方法劳动强度高、材料消耗大且耗时，每个样本通常需要半天的时间[9]、[10]。相比之下，（ii）SEC-UV是一种潜在的更快替代方法。该方法利用基于大小的分离来区分抗体结合物和游离螯合剂/药物或片段。它可以根据抗体和结合螯合剂的独特紫外吸收特性来量化CAR[2]。然而，这种方法仅适用于有限数量的结合物。例如，可以使用Fe(III)在其对应的430 nm紫外吸收峰处来确定DFO免疫结合物的CAR[11]。最后，（iii）（LC-）MS也可以用于CAR的测定。然而，到目前为止，这主要是通过反相液相色谱（RPLC）进行的，这是一种变性分离技术[9]。并非所有连接剂（如硫脲连接剂）在有机条件下都是稳定的，这可能导致CAR的误解读。

除了诊断应用（例如PET成像）之外，免疫结合物还被开发为药物和先进的药物递送系统，特别是作为抗体-药物结合物（ADCs），已有几种结合物上市（例如ado-曲妥珠单抗嵌合体emtansine）[12]。ADCs在结构上类似于RICs，因为两者都是基于mAb的，并采用类似的共轭策略。然而，ADCs通常携带更多的疏水性细胞毒性药物载荷，而RICs通常结合更亲水性的放射性核素螯合剂。已经开发了几种用于ADC表征的分析方法，特别关注载荷分布（药物与抗体的比例（DAR））、蛋白质结构完整性以及结合位点的分析[13]。对于DAR的测定，最常用的分析技术包括疏水相互作用色谱（HIC）[14]、[15]、[16]、RPLC [17]、[18]、[19]或原位SEC-MS [20]、[21]、[22]，以及最近推出的缓冲液交换质谱（商业上称为“IPT sample stream”[23]。

选择合适的技术取决于具体的共轭策略。LC方法，如HIC和RPLC，常用于DAR的测定，因为它们可以在液相中分离DAR物种并通过紫外检测进行量化。然而，HIC虽然适用于确定半胱氨酸连接的ADCs的DAR物种，但通常不适用于赖氨酸连接的ADCs。赖氨酸残基上大量的潜在和随机结合位点导致结合物的广泛和异质分布。因此，在HIC中，具有相同DAR但不同结合位置的ADC物种表现出不同的疏水性。然而，这些差异不足以区分同分异构结构（来自相同数量的连接物种，连接到不同的氨基酸残基）。结果，对于赖氨酸连接的ADCs，观察到的是宽泛的、未分离的峰，而不是清晰、可分离的物种。此外，由于依赖于非挥发性盐，HIC难以与MS耦合进行详细的药物鉴定[16]。

相比之下，RPLC分离可以直接与MS耦合进行DAR的测定。虽然RPLC是一种多功能方法，但对于可能无法承受变性条件的半胱氨酸连接和免疫结合物，完整的分析往往不可行。半胱氨酸连接免疫结合物的共轭过程需要切割链间二硫键并去除mAb内的关键共价交联。这种结构完整性的丧失使得抗体在RPLC过程中暴露于变性溶剂时容易解离成重链和轻链亚单位[18]。此外，并非所有连接剂化学性质在严苛的RPLC条件下都是稳定的，特别是那些含有高有机修饰剂和低pH值的连接剂。这些条件可能导致免疫结合物的部分或完全分解。

因此，原位方法，如原位SEC或缓冲液交换质谱，提供了一个有价值的替代方案[20]、[21]、[22]、[23]。这些方法依赖于原位MS进行DAR的测定；尽管它们可能无法提供单个DAR物种的特定色谱分离，但可以应用于更广泛的ADC化学性质，包括那些具有更敏感连接剂的ADCs，如半胱氨酸连接的ADCs。然而，免疫结合物是通过将带电的、更亲水的配体连接到mAb上形成的，因此在SEC和MS中的行为不同，包括吸附倾向和化学稳定性。因此，已经优化了几种SEC参数以减少吸附，例如缓冲液浓度，从而实现了一种通用的免疫结合物分析方法。

我们的研究通过开发一种微流控原位SEC-MS方法来填补免疫结合物表征中的一个关键分析空白[24]，用于表征它们的CAR。这种新方法与传统的免疫结合物测定方法进行了比较，特别是放射滴定和SEC-UV。尽管放射滴定被广泛使用，但它劳动强度高、耗时且材料消耗大，每个样本通常需要半天的时间，形成了一个显著的分析瓶颈。

部分片段

化学品

乙腈（ACN）和三氟乙酸（TFA）从Biosolve B.V.（荷兰瓦尔肯斯瓦德）购买。醋酸铵从Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）获得。所有水都经过去离子处理（Arium 611UV；德国哥廷根Sartorius）。阿姆斯特丹大学医学中心（荷兰阿姆斯特丹）的放射学和核医学部门合成了免疫结合物样品。合成免疫结合物样品的程序在

结果与讨论

在这项研究中，分析了四种免疫结合物模型，它们都含有螯合剂DFO，但在连接剂和间隔成分上有所不同。这些样品基于mAb曲妥珠单抗。在最后一部分中，还测试了各种免疫结合物和螯合剂；伊匹木单抗（DFO）、利妥昔单抗（DOTA）和纳米抗体（RESCA）也被分析，以展示该方法的更广泛适用性（详见第3.3节）。

三种免疫结合物是通过赖氨酸残基进行共轭的

结论

确定含有亲水性螯合剂的免疫结合物的平均CAR是一个漫长的过程，特别是使用典型的放射滴定法。为了解决这一问题，我们成功开发并优化了一种微流控原位SEC-MS方法，可以在不进行任何广泛样品制备（如脱盐）的情况下在原位水平上测定CAR。

方法优化表明，600 mM醋酸铵（pH 6.8）的高缓冲液浓度可以有效减少

CRediT作者贡献声明

安德烈亚·F.G. 加尔加诺（Andrea F. G. Gargano）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，监督，资源管理，项目管理，方法学，概念化。丹妮尔·J. 维格茨（Danielle J. Vugts）：撰写 – 审稿与编辑，资源管理。布拉姆·韦耶尔斯（Bram Weijers）：撰写 – 原始草稿，资源管理，研究。安妮卡·A.M. 范德宗（Annika A.M. van der Zon）：撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，研究，形式分析，概念化

披露声明

作者声明没有需要声明的竞争利益。

竞争利益声明

? 作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

我们要感谢阿姆斯特丹大学的Huda Husein进行初步实验，以及阿姆斯特丹自由大学的Joshka Verduin进行科学讨论。感谢Marie Velada Dugois和Sabine Nauta（阿姆斯特丹UMC）提供免疫结合物。