《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：An integrated framework identified potent inhibitors targeting IRE1α
编辑推荐：
黄酮类化合物通过抑制IRE1α激酶活性调控未折叠蛋白反应介导的炎症反应。研究采用多对接策略（AutoDock Vina/Wizard/iGEMDOCK）对357种黄酮进行虚拟筛选，结合分子动力学模拟和体外激酶抑制实验，发现amentoflavone和glycitein对IRE1α具有显著抑制活性（IC50分别为16.4和23.68 μM），同时通过激活XBP1 splicing调节ER应激相关炎症。本研究首次揭示黄酮类化合物具有双重调节功能，为开发新型抗炎药物提供理论依据。
苏布拉马尼扬·迪维亚（Subramaniyan Divya）|普里蒂·塔尔瓦尔（Priti Talwar）|帕拉尼扬迪·拉瓦南（Palaniyandi Ravanan）
印度泰米尔纳德邦中央大学生命科学学院微生物学系功能基因组学实验室，蒂鲁瓦鲁尔（Thiruvarur）610005
摘要
肌醇依赖性酶1（IRE1α）是未折叠蛋白反应（UPR）的关键传感器和信号效应器之一，对于维持内质网（ER）的稳态至关重要。IRE1α信号传导的失调可能导致多种疾病。最初，我们使用AutoDock Vina、AutoDock Wizard和iGEMDOCK等多 docking方法预测黄酮类化合物库与IRE1α的结合亲和力，并根据亲和力对其进行排序。随后，通过后对接方法进一步筛选候选化合物。最终，根据较高的结合亲和力和在激酶活性位点的ATP结合口袋中的强结合能力，选出了排名最高的黄酮类化合物。体外激酶实验表明，阿门托黄酮（Amentoflavone）和甘氨酸黄酮（Glycitein）显著抑制了IRE1α的激酶活性，其IC50值分别为16.4 μM和23.68 μM。细胞实验显示，这些黄酮类化合物具有抗炎特性，并在正常条件下显著促进XBP1剪接和IRE1α的表达。相反，黄酮类化合物的预处理显著减弱了LPS诱导的IRE1α–XBP1信号传导并降低了炎症反应。总体而言，我们的结果表明阿门托黄酮和甘氨酸黄酮对IRE1α具有显著的调节作用。据我们所知，这是首次报道阿门托黄酮和甘氨酸黄酮同时具有IRE1α激酶抑制和RNase激活特性的研究。这项工作为开发基于黄酮类的IRE1α抑制剂以治疗内质网应激及相关炎症疾病提供了有价值的基础。
引言
内质网（ER）通过协调的转录和翻译变化来调节蛋白质折叠能力，从而触发称为未折叠蛋白反应（UPR）的细胞内网络。UPR主要由三个相互依赖的信号通路调节：肌醇依赖性酶1（IRE1α）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）和激活转录因子6（ATF6）。由于IRE1α在生理和病理作用中的重要性，其在多种疾病中的调节作用已在多种临床前研究中得到广泛研究。IRE1α是一种跨内质网膜蛋白，具有感测结构域以及串联的激酶和内切核糖核酸酶（RNase）胞质结构域。内质网腔内过多的未折叠蛋白质通过二聚化和寡聚化诱导IRE1α蛋白的构象变化，导致其两个激酶结构域的自磷酸化及随后的RNase激活。有趣的是，IRE1α的RNase功能仅在激酶结构域发生构象变化后才会被激活。随后，它以非传统方式剪接XBP1 mRNA，产生XBP1，这是一种能够调控多种UPR靶基因表达的强效转录因子。
在治疗开发中，通过遗传或药理学手段调节IRE1α是一个有前景的策略，因为其活性可以显著影响细胞存活和功能，使其成为代谢紊乱、癌症和神经退行性疾病的关键治疗靶点。尽管如此，药物发现仍然是一项艰巨的任务。分子对接作为一种基于计算结构的强大药物发现技术，通过快速筛选大量化合物库，大大减少了实验试验的时间和经济成本。它根据蛋白质-配体相互作用特征识别潜在候选分子。尽管分子对接有助于快速筛选和排序，但也存在局限性，例如在大数据集中的对接预测准确性可能较低，这可能是由于评分函数、构象采样算法以及蛋白质结构的静态特性未能完全反映生物相互作用的动态特性。蛋白质靶点的灵活性是虚拟筛选中出现假阳性和假阴性错误的主要原因，因为分子配体和受体位点或别构位点存在多个可旋转键，导致活性化合物的错误排序和配体-靶点相互作用的构象多样性增加。最近的研究采用了多种对接方法来克服这些挑战，包括结合姿态验证、相互作用分析、共识评分和对接结果的重新排序。这些方法通过提高可靠性和减少工具特定偏差来优化候选化合物的筛选。经过对多种对接程序的长时间验证后，没有一种程序具有绝对优势，因此在单一平台上结合不同的对接工具可能实现更好的预测效果。此外，还通过计算机模拟方法评估了候选黄酮类化合物的药代动力学特性、膜渗透性和潜在毒性。
历史上，天然产物因其结构多样性和针对炎症、癌症和代谢疾病的保守分子途径的生物活性而有助于疾病治疗。天然产物及其衍生物在靶点依赖性药物发现中发挥着重要作用，该方法整合了结构生物学、计算建模和生化验证，以优化具有高靶点特异性的化合物。黄酮类化合物是一类存在于植物中的多酚化合物，由于其广泛的药理活性而逐渐受到关注。多项研究表明，包括山柰酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）、伊卡林（Icariin）、纳林根宁（Naringenin）、吴贡苷（Wogonoside）和白藜芦醇（Baicalein）等黄酮类化合物通过调节内质网应激途径在多种病理条件下表现出保护作用。这些化合物影响关键分子事件，如胃癌中的IRE1-JNK-CHOP信号通路，减轻铅诱导的肝毒性，表现出抗炎和抗氧化活性，并根据细胞环境促进或抑制自噬。先前的结构研究表明，槲皮素、米瑞辛（Myricetin）和沃特曼宁（Wortmannin）等黄酮类化合物可以占据激酶的ATP结合口袋，以纳摩尔浓度抑制其催化活性。这种结构兼容性、维持内质网稳态的能力以及调节UPR信号传导的能力表明，黄酮类化合物可能通过别构或ATP竞争机制抑制IRE1α的激酶活性。
为了进一步验证黄酮类化合物作为IRE1α（内质网中的关键应激传感器和信号效应器）的潜在候选物的假设，我们构建了一个包含357种结构多样的黄酮类化合物的库，并采用基于结构的虚拟筛选策略来识别具有治疗潜力的新型IRE1α激酶抑制剂。通过多种对接平台，我们通过共识重新排序和临界值分析实现了稳健的候选化合物筛选，克服了单个对接工具的固有局限性。使用AutoDock Vina、AutoDock Wizard和iGEMDOCK筛选357种黄酮类化合物后，根据结合亲和力、一致性和靶点结合情况对结果进行了过滤、优先排序。使用体外激酶抑制实验验证了排名最高的五种化合物。甘氨酸黄酮和阿门托黄酮显示出显著的激酶抑制活性和剂量依赖性，证实了它们作为有前景的IRE1α激酶抑制剂的潜力。体外细胞实验表明，所选黄酮类化合物在正常条件下能诱导XBP1 mRNA剪接为XBP1转录因子，但在LPS诱导的炎症状态下则不能。这些发现表明，针对内质网应激相关疾病的黄酮类化合物疗法可以进一步进行临床前评估和结构优化，以提高疗效。
分子对接
本研究使用三种不同的分子对接工具，研究了包含357种黄酮类化合物的库与IRE1α靶蛋白的相互作用。首先，所有357种黄酮类化合物和阳性对照配体山柰酚的结构从PubChem和人类代谢组数据库中获取，并使用Open Babel软件转换为PDB格式。作为靶蛋白的是与ADP结合的人类IRE1α晶体结构（PDB ID:
3P23）。
通过计算机模拟多 docking方法鉴定黄酮类化合物作为新的IRE1α调节剂候选物
使用三种不同的对接程序Autodock Vina、Autodock Wizard和iGMDOCK进行了彻底的虚拟筛选，以筛选针对IRE1α蛋白的高效黄酮类化合物。这些程序采用了不同的对接算法，包括复杂的梯度优化算法、拉马克算法和遗传算法。所有三种工具均用于评估357种黄酮类化合物与IRE1α的结合相互作用，并根据结合亲和力对它们进行排序。
讨论
IRE1α作为内质网应激的传感器，在维持内质网稳态中起着关键作用，其失调与多种疾病相关。最近，使用小分子靶向IRE1α成为一种有前景的治疗策略。本研究旨在通过分子对接筛选包含357种黄酮类化合物的库与IRE1α靶蛋白的相互作用。X射线晶体学研究表明，黄酮类化合物的环结构和羟基取代基在其中起重要作用。
结论
本研究系统评估了一系列黄酮类化合物调节IRE1α信号传导的能力，IRE1α是UPR通路的关键组成部分。我们利用计算和实验方法发现了阿门托黄酮和甘氨酸黄酮作为潜在的IRE1α激酶抑制剂。我们旨在更深入地了解黄酮类化合物与IRE1α之间的分子相互作用及其对IRE1α-XBP1信号通路的后续影响。这两种黄酮类化合物均显著降低了激酶活性。
作者贡献
P.R.构思了项目并设计了实验，D.S.进行了实验。数据分析和手稿撰写由P.R.、D.S.和P.T.完成。
作者贡献声明
苏布拉马尼扬·迪维亚（Subramaniyan Divya）：撰写——原始草案。普里蒂·塔尔瓦尔（Priti Talwar）：撰写——审阅与编辑、方法学。帕拉尼扬迪·拉瓦南（Palaniyandi Ravanan）：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草案、可视化、验证、监督、资源管理、方法学、研究设计、资金获取、数据管理、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
PR衷心感谢印度科学与工程研究委员会（Science and Engineering Research Board, SERB/EEQ/2021/000061）提供的财政支持。
