《Experimental Cell Research》：Microtubule-stabilizer epothilone B counteracts anesthetic-induced slowed swimming in
Tetrahymena pyriformis
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挥发麻醉剂异氟烷通过干扰微管蛋白影响单细胞生物四膜虫的游动速度，预处理细胞使用微管稳定剂依波替隆可逆转其麻醉效应，支持哺乳动物与单细胞生物麻醉机制的高度保守性。
Xinyue Yu|Zitong Qiu|Fabiha Nashrah|Anika Garg|Abbie Chang|Alison Schieber|Sophia Wu|Vijayalakshmi Magavi|Michael C. Wiest
韦尔斯利学院神经科学系，地址：106 Central St., Wellesley MA 02481
摘要
挥发性麻醉剂能够使人类暂时失去行动能力和意识，它们对非神经生物（包括植物和单细胞生物）的运动能力也有类似的可逆影响。其具体作用机制尚不清楚，但由于不同组织和细胞类型之间的复杂相互作用，在哺乳动物中进行研究较为困难。本文利用免费软件研究了单细胞纤毛虫Tetrahymena pyriformis的游动速度。我们首先扩展了之前关于其他挥发性麻醉剂的研究结果，证明异氟醚同样能可逆地降低Tetrahymena的游动速度。
随后我们发现，预先使用微管稳定剂epothilone B（10 nM）可以增强细胞对异氟醚麻醉作用的抵抗力。这一结果表明，异氟醚可能通过作用于微管来减缓细胞游动。这一结论与我们之前的实验结果一致，即异氟醚能够通过结合微管导致大鼠和小鼠失去意识。因此，我们的研究支持所有纤毛虫都对挥发性麻醉剂敏感的观点，并证实了挥发性麻醉剂在单细胞生物和哺乳动物中具有保守的分子作用机制。此外，我们的实验方法还便于低成本、高效率地检测挥发性麻醉剂在纤毛虫中的特定作用靶点。
引言
1878年，法国生理学家Claude Bernard提出：“有生命的生物必须具有感知能力，并且可以被麻醉；否则就属于死亡。”他基于观察到某些气体（如乙醚）既能麻醉人类和其他哺乳动物，又能使植物停止运动，从而提出了这一大胆猜想。现代研究证实了这一观点。
类似地，50多年前，Nunn等人[4]证明单细胞纤毛虫Tetrahymena pyriformis（显然没有神经系统）也能被麻醉，表现为游动速度的可逆性降低。类似地，麻醉气体对淋巴细胞[5]、精子细胞[6]和细菌[7]的运动能力也有类似的影响。这些发现支持Bernard的猜想，表明挥发性麻醉剂的作用机制可能在不同神经和非神经物种中具有保守性。
关于挥发性麻醉剂（及其他麻醉剂）的潜在作用靶点，已有大量研究[8]，包括突触蛋白和配体门控受体（如GABA受体[9, 10]）、各种离子通道[11, 12, 13, 14]、线粒体[15, 16]以及细胞骨架微管蛋白[17, 18, 19, 20, 21, 22]等。
当代麻醉神经科学研究主要集中在调节神经活动的分子靶点上，如突触蛋白和离子通道[8, 23, 24]，以及对特定类型神经元（如促进睡眠的神经元[25, 26]）的影响。然而，在哺乳动物甚至无脊椎动物中确定这些分子靶点的功能作用极具挑战性，因为（i）后生动物包含多种组织和细胞类型，使得实验结果难以解读；（ii）分子效应通常需要单独实验进行检测，且与测量无意识或静止状态的行为实验尺度不同。
由于许多潜在的分子靶点在单细胞生物（如纤毛虫）中也存在，它们可以作为研究特定分子靶点功能的强大模型[27, 28]。为了在后生动物和单细胞生物之间进行比较，我们需要对麻醉状态的定义进行推广。在哺乳动物中，麻醉状态的特征是可逆的运动丧失和意识丧失（即催眠状态）。将这一定义推广到纤毛虫时，我们认为麻醉是一种运动能力下降和对感官刺激反应减弱的可逆状态[8, 29]。这一定义保留了Bernard提出的感觉作用的基本概念。
Tetrahymena是首个被证明可以被麻醉的纤毛虫[4]，它含有离子通道、线粒体和微管[8]。根据[28]的研究，我们采用了一种低成本的方法来检测挥发性麻醉剂的保守作用机制，并利用微管稳定剂epothilone B（epoB）来验证异氟醚是否通过作用于微管来减缓Tetrahymena的游动速度。我们之前已经证明epoB可以延缓异氟醚引起的大鼠[20]和小鼠[30]的意识丧失（包括运动停止）。蝌蚪[19]和人类手术患者[31]的类似结果也支持微管是麻醉作用的靶点。我们的假设认为，epoB的存在会干扰异氟醚对微管的作用，从而减弱其对游动速度的抑制效果。
方法
细胞培养和epothilone B药物处理：Tetrahymena pyriformis细胞（图1A）由Carolina Biological Supply Company提供（产品编号#13-1620）。收到后，将细胞分成多个100 x 15 mm的培养皿，并用原生动物培养基（Carolina Biological产品编号#13-2350）稀释，或直接从运输管中取样。将epothilone B（Millipore Sigma E2656）溶解在DMSO中，再进一步用原生动物培养基稀释超过一百万倍。
结果
为了验证异氟醚是否可逆地降低Tetrahymena pyriformis的游动速度，我们在细胞暴露于氧气或4-5%异氟醚（含氧气）30分钟后测量了它们的游动速度。同时，我们还比较了在10 nM epoB中孵育的细胞与未处理的对照组细胞的游动速度，以确定epoB是否能抵消异氟醚的抑制作用。
我们的
讨论
我们首先发现，Tetrahymena pyriformis在暴露于4%或5%异氟醚（含氧气）30分钟后，游动速度会显著下降。随后我们发现，如果细胞预先在10 nM epoB中孵育，异氟醚的抑制作用会显著减弱。
异氟醚的效果：我们的结果与[4]的研究结果一致，他们发现卤烷和其他挥发性麻醉剂也会降低Tetrahymena的游动速度。
作者贡献声明
Alison Schieber：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据管理。Abbie Chang：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据管理。Anika Garg：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据管理。Fabiha Nashrah：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据分析、数据管理。Zitong Qiu：撰写、审稿与编辑、项目监督、方法设计、实验设计、数据分析。Xinyue Yu：撰写、审稿与编辑、项目监督。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本项目未获得外部资助。XY的工作得到了韦尔斯利学院神经科学系Klein基金的支持，ZQ的工作得到了韦尔斯利学院Helen Wallace ’33夏季研究基金的支持。
